茯苓多糖的酶解工藝及抑菌性研究

李世杰，李 勇，曾海英*

（貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

茯苓（Poria cocos）又名茯菟、萬靈桂、茯靈等[1]，是一種寄生于松科植物馬尾松或赤松等樹根上，擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）非褶菌（Aphyllophorales）多孔菌科（Polyporaceae）的真菌干燥菌核[2]，在我國分布廣泛，主要分布在云南、廣西、廣東、福建、安徽、湖北、貴州等地，以云南產(chǎn)的最好[3-4]。茯苓多糖為茯苓的主要成分，約占菌核干質(zhì)量的80%左右，絕大部分存在于茯苓細胞壁中[5]?，F(xiàn)代研究表明，茯苓多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗癌抗腫瘤、消炎利尿、延緩衰老等生理活性作用且療效顯著[6-10]。茯苓多糖可分為水溶性茯苓多糖和堿性茯苓多糖，其中絕大部分為堿性茯苓多糖，不溶于水[11]。因此，大部分茯苓多糖無法被人體有效吸收，生物活性利用率極低[12]，故將不溶于水的堿性茯苓多糖更多地降解為生物活性高且易于吸收的短鏈小分子水溶性茯苓多糖具有十分重要的意義。β-葡聚糖酶是指可將β-葡聚糖降解為小分子多糖片段的酶，對β-葡聚糖具有重要的水解作用，主要來源于微生物[13]。采用β-葡聚糖酶酶解茯苓多糖，與已有的化學(xué)、物理等降解方法相比，具有專一性強、反應(yīng)迅速、條件溫和、無污染等優(yōu)點，是一種較為理想的獲得水溶性茯苓多糖的方法[14-15]。陳小紅等[16]對大分子茯苓多糖進行了羧甲基化和阿魏酸結(jié)構(gòu)改性，發(fā)現(xiàn)在一定的濃度范圍內(nèi)，降解改性后的茯苓多糖具有一定的還原能力和抗氧化能力，但采用化學(xué)改性方法存在化學(xué)試劑殘留、產(chǎn)物提純較為困難等缺點。物理降解主要是指通過超聲波破碎、輻照降解等方法對多糖進行物理修飾，該方法能有效節(jié)約了能源和時間、簡化操作程序、減少了有機溶劑的使用，但專一性不強，降解轉(zhuǎn)化效率低[17]。本試驗采用酶解法酶解茯苓多糖，通過正交試驗得到最佳酶解工藝，并對酶解后所得水溶性茯苓多糖進行了抑菌性研究，為擴大茯苓多糖在食品加工中的應(yīng)用范圍，為茯苓產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)和擴大茯苓資源綜合利用率提供試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯苓：貴州省黔東南州黎平縣森泰靈寶有限公司；β-葡聚糖酶（5×104U/g）：上海源葉生物科技有限公司。

濃硫酸：天津市富宇精細化工有限公司；苯酚、葡萄糖、檸檬酸、磷酸氫二鈉、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。試劑均為分析純，蒸餾水為實驗室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-8D型恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用途真空泵：鄭州長城科工貿(mào)易有限公司；101-0AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱、CJ-1D型超凈工作臺：天津市泰斯特儀器有限公司；TU-1810型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料前處理

將茯苓原料洗凈去皮切塊，置于105℃烘箱中烘干至質(zhì)量恒定，粉碎機粉碎，過40目篩，置于干燥塑料密封袋中貯藏備用。

1.3.2 標準曲線的制作[18]

精確稱取105℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖100 mg，加水溶解至500 mL容量瓶中定容。精密分別吸取葡萄糖溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于20 mL具刻試管中，補蒸餾水至4.0 mL，快速分別加入5%苯酚溶液2.0 mL，濃硫酸6.0 mL，搖勻室溫靜置30 min，在波長490 nm處檢測吸光度值。以吸光度值（Y）為縱坐標，葡萄糖質(zhì)量濃度（X）為橫坐標繪制葡萄糖標準曲線，得出回歸方程為Y=0.0008X+0.001 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。

1.3.3 單因素試驗

（1）酶解溫度的影響

準確稱取7 000 Uβ-葡聚糖酶，溶解于10 mL、37℃的蒸餾水中，并水浴活化10min。稱取過40目篩的茯苓粉2.0g，置于150 mL錐形瓶中，加入60 mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液（pH6.0），并將已活化酶液加入錐形瓶中，攪拌振蕩使之充分混勻。分別置于溫度為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的水浴鍋中反應(yīng)，90 min后將錐形瓶置于沸水中水浴10 min進行酶的滅活處理。將反應(yīng)液趁熱抽濾，濾液定容至250 mL，取1.0 mL定容液于20 mL試管中，實驗步驟與制作標準曲線步驟相同，采用苯酚-硫酸法在波長490 nm處檢測其吸光度值，計算反應(yīng)液中水溶性多糖的含量，比較得出最適酶解溫度。

（2）酶解pH值的影響

使用不同pH值的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液分別調(diào)節(jié)酶解反應(yīng)pH值為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，反應(yīng)時間為90min、酶用量為7 000 U、反應(yīng)溫度為（1）中最適溫度，操作步驟與1）相同，計算水溶性多糖的含量，比較得出最適酶解pH值。

（3）酶解時間的影響

將酶解反應(yīng)溫度、酶解反應(yīng)pH值分別設(shè)定為（1）和（2）中最適值，酶用量為7 000 U保持不變，反應(yīng)時間分別設(shè)定為60 min、90 min、120 min、150 min、180 min，操作方法（1）上，計算比較得出最適酶解時間。

（4）酶用量的影響

酶解反應(yīng)溫度、酶解反應(yīng)pH值、酶解反應(yīng)時間均設(shè)定為以上各步驟中確定的最適值，分別設(shè)定酶用量為3000U、5 000 U、7 000 U、9 000 U、11 000 U，試驗步驟同上，計算水溶性多糖含量，比較得出最適酶用量。

1.3.4 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇酶解溫度、酶解pH值、酶解時間和酶用量4個因素進行正交試驗，每個因素分別選擇3個水平，設(shè)計L9（34）正交試驗，以水溶性茯苓多糖含量為考察指標，確定最佳酶解茯苓多糖工藝條件。正交試驗因素及水平見表1。

表1 酶解茯苓多糖條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments forP.cocos polysaccharide enzymolysis conditions optimization

1.3.5 抑菌試驗[19]

抑菌試驗采用牛津杯法進行，具體操作步驟如下：將實驗室自有的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中于37℃條件下活化培養(yǎng)18～24 h。將已活化的菌種以10倍稀釋法分別稀釋至濃度為5.0×107CFU/mL，并接種到營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基表面。將酶解所得水溶性茯苓多糖配制為1.0 mg/mL溶液，以無菌操作加入置于培養(yǎng)基表面的牛津杯中，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察抑菌效果并測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶解溫度對水溶性多糖含量的影響

圖1 酶解溫度對多糖含量的影響Fig.1 Effect of enzymolysis temperature on polysaccharide content

由圖1可知，在酶解pH值為6.0、酶解時間90 min、酶用量為7 000 U的條件下，水溶性多糖的含量隨溫度的升高

呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢。酶解溫度為40～50℃時，隨著溫度的升高，水溶性多糖的含量隨之增加；酶解溫度為50℃時，多糖含量達到最大，為7.38%；溫度超過50℃，多糖含量反而減少，可能是由于溫度超過最適溫度后，β-葡聚糖酶出現(xiàn)變性，導(dǎo)致酶活力下降，從而降低了酶解茯苓多糖轉(zhuǎn)化為水溶性茯苓多糖的效率。而溫度過低也會降低酶解反應(yīng)速率。因此選擇最適酶解溫度為50℃。

2.1.2 酶解pH值對水溶性多糖含量的影響

圖2 酶解pH值對多糖含量的影響Fig.2 Effect of enzymolysis pH on polysaccharide content

由圖2可知，在酶解溫度50℃、酶解時間90 min、酶用量7000U的條件下，水溶性多糖的含量隨酶解pH值的升高呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢。酶解pH值為4.5～5.5時，水溶性多糖含量明顯增加；酶解pH值為5.5時，水溶性多糖含量達到最大為8.27%；隨著酶解pH值的繼續(xù)升高，多糖含量反而有所下降，可能是由于酶與茯苓底物結(jié)合率降低所致。因此選擇最適酶解pH值為5.5。

2.1.3 酶解時間對水溶性多糖含量的影響

圖3 酶解時間對多糖含量的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on polysaccharide content

由圖3可知，在酶解pH值為5.5、酶解溫度為50℃、酶用量為7 000 U的條件下，水溶性多糖的含量隨酶解時間的延長呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的變化趨勢。酶解時間為60～90 min時，茯苓水溶性多糖含量隨著酶解時間的增加迅速增加；酶解時間為90～120 min時，水溶性多糖的含量呈現(xiàn)緩慢上升趨勢；在酶解時間為120 min時，多糖含量達到最大為9.10%；在酶解時間為120～180 min時，多糖含量略有降低且趨于穩(wěn)定，可能是酶解時間過長導(dǎo)致糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生了碳鏈裂解等變化，水溶性多糖含量并無增加反而略有減少，結(jié)果與李慧等[12]采用輻照-木聚糖酶協(xié)同降解轉(zhuǎn)化茯苓多糖結(jié)果一致。因此選擇最適酶解時間為120 min。

2.1.4 酶用量對水溶性多糖含量的影響

圖4 酶用量對多糖含量的影響Fig.4 Effect of enzyme addition on polysaccharide content

由圖4可知，在酶解pH值為5.5、酶解溫度為50℃、酶解時間為120 min的條件下，水溶性多糖的含量隨酶用量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢。當β-葡聚糖酶用量為3 000～7 000 U時，水溶性茯苓多糖的含量顯著增加；當酶用量＞7 000 U時，隨著酶用量的繼續(xù)增加，水溶性茯苓多糖的含量不再繼續(xù)增加，呈現(xiàn)緩慢降低并趨平穩(wěn)趨勢。在底物濃度一定的情況下，隨著酶用量的增加，水溶性茯苓多糖的含量有所增加，但并非酶用量越大水溶性茯苓多糖的含量就越高，這可能是由于酶與底物的作用已經(jīng)達到飽和狀態(tài)所引起的，因此選擇最適β-葡聚糖酶用量為7000U。

2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選用L9（34）正交試驗考察酶解溫度（A）、酶解pH值（B）、酶解時間（C）、酶用量（D）對水溶性茯苓多糖含量的影響，試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 酶解茯苓多糖條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments forP.cocos polysaccharide enzymolysis conditions optimization

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，酶解溫度、酶解pH值、酶解時間、酶用量4個因素的極差值大小順序為RD＞RA＞RB＞RC，說明影響水溶性多糖含量因素的主次順序依次為：酶用量、酶解溫度、酶解pH值、酶解時間。由表3可知，試驗所選4個因素對水溶性茯苓多糖含量影響均效果顯著，故β-葡聚糖酶酶解茯苓多糖的最佳工藝組合為A3B2C3D3，即酶解溫度為55℃、酶解pH值為5.5、酶解時間為150 min、酶用量為9 000 U。采用最佳工藝組合條件進行3次重復(fù)驗證試驗，水溶性多糖含量分別為9.24%、9.16%、9.21%，平均值為9.20%。

2.3 抑菌試驗結(jié)果

采用牛津杯法進行抑菌性試驗，水溶性多糖溶液的質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，3種菌液的濃度為5.0×107CFU/mL，無菌操作，37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h，取出觀察結(jié)果并拍照，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，經(jīng)酶解所得產(chǎn)物水溶性茯苓多糖對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有較好的抑菌作用，對枯草芽孢桿菌未見產(chǎn)生抑菌作用。經(jīng)過測量，金黃色葡萄球菌與大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為14.67 mm、8.89 mm，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，試驗結(jié)果表明，1.0 mg/mL的水溶性茯苓多糖溶液對革蘭氏陽性菌的抑菌作用強于革蘭氏陰性菌，對枯草芽孢桿菌未見明顯抑菌作用。

圖5 水溶性多糖抑菌效果Fig.5 Antibacterial effect of water-soluble polysaccharide

3 結(jié)論

以β-葡聚糖酶為外源酶酶解茯苓多糖，并在此基礎(chǔ)上探尋最佳酶解工藝條件，以期獲得更高含量的水溶性茯苓多糖并研究其抑菌效果。通過對酶解溫度、酶解pH值、酶解時間及酶用量4個因素的單因素試驗，獲得各因素的最佳水平，通過L9（34）正交試驗綜合得出最佳酶解工藝條件，酶解溫度55℃、酶解pH為5.5、酶解時間為150 min、酶用量為9 000 U。在最佳條件下水溶性茯苓多糖含量的均值為9.20%。在進行茯苓水溶性多糖的細菌抑菌性試驗結(jié)果表明，1.0 mg/mL水溶性茯苓多糖溶液對革蘭氏陽性菌的金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌的大腸桿菌均有明顯的抑菌作用，且對革蘭氏陽性菌的抑制作用強于陰性菌，對枯草芽孢桿菌未見產(chǎn)生抑菌作用。

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