一株刺盤孢屬菌的分類鑒定及轉(zhuǎn)化孕酮和雄烯二酮的研究

張廣求，段焰青，馬慧宇，劉 赟，杜 剛*

（1.云南民族大學(xué) 電氣信息工程學(xué)院云南 昆明 650500；2.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650202；3.云南煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站，云南 昆明 650106；4.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國家民族事務(wù)委員會(huì)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500）

甾體化合物又稱類固醇化合物，是含有環(huán)戊烷多氫菲核化合物的總稱，母核結(jié)構(gòu)由三個(gè)六元環(huán)和一個(gè)五元環(huán)構(gòu)成，甾體化合物隨母核上取代官能團(tuán)和環(huán)上氧化狀態(tài)的差異，具有的特定的生理活性，常見的活性甾體類化合物包括性激素、腎上腺皮質(zhì)激素、甾醇、膽汁酸、強(qiáng)心苷、甾體皂苷、甾體生物堿等[1]。

微生物轉(zhuǎn)化甾體化合物具較好的選擇性，在甾體藥物的研究和生產(chǎn)中有重要的地位[2]，一些微生物轉(zhuǎn)化過程已被成功地整合到甾體藥物和關(guān)鍵中間體的生產(chǎn)中[3-4]，甾體的微生物轉(zhuǎn)化類型包括羥基化、脫氧、氧化還原、環(huán)氧化等[5-7]。很多微生物菌株可實(shí)現(xiàn)甾體羥基化，如青霉菌、鏈霉菌、毛霉、曲霉、根霉、小克銀漢霉等[8-11]。刺盤孢屬菌株進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化已有很多研究，ARUNRATTIYAKORN P等[12]以刺盤孢屬菌株MAT02轉(zhuǎn)化α-倒捻子素，獲得新穎的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；NUMPAQUE M A等[13]以尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）轉(zhuǎn)化阿魏酸為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，產(chǎn)生香莢蘭乙酮、香草醛和乙基愈創(chuàng)木酚等香味物質(zhì)，WU Y等[14-15]在微生物轉(zhuǎn)化甾體的研究中，亞麻刺盤孢菌株（Colletotrichum lini）ST-1可轉(zhuǎn)化4-雄烯二酮（4-androstenedione，4-AD）為11α,15α-二羥基-4-雄烯二酮，轉(zhuǎn)化孕酮為15α-羥基孕酮，轉(zhuǎn)化睪酮為11α,15α-二羥基睪酮。以上研究，可得到甾體化合物多樣化的衍生物，為甾體藥物篩選和生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。

尋找新的甾體轉(zhuǎn)化菌株是甾體工業(yè)發(fā)展的重要課題，本研究從滇重樓根狀莖中分離到一株能轉(zhuǎn)化孕酮和4-AD的刺盤孢屬菌株YNCA0116，并對其進(jìn)行分類鑒定和轉(zhuǎn)化研究，以期為研究和開發(fā)甾體藥物提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

轉(zhuǎn)化菌株為實(shí)驗(yàn)室保藏菌株，分離自滇重樓根狀莖，菌株實(shí)驗(yàn)室編號(hào)為YNCA0116。

1.1.2 試劑

孕酮和4-AD標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：江蘇省鹽城信誼醫(yī)藥化工有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）試劑（瓊脂糖、DNATaq酶Mix、引物ITS4、ITS5等）：上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。其他試劑均為分析純：購自國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：蔗糖2.0%，馬鈴薯20.0%，瓊脂2.0%，pH自然。

種子培養(yǎng)基：蔗糖2.0%，馬鈴薯20.0%，pH自然。

孕酮或4-AD轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為察氏培養(yǎng)基：NaNO30.3%，K2HPO40.1%，KCl 0.005%，MgSO4·7H2O 0.05%，蔗糖2.0%，孕酮或4-AD 0.1%，吐溫-80 0.2%，pH自然。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-ZFD超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-40BI電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；HP-900恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；ZHWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；AR224 CN電子天平：奧豪斯國際貿(mào)易上海有限公司；KS-600D超聲波清洗器：寧波科勝儀器廠；RⅡ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；Agilent 1100分析型高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；XT-4熔點(diǎn)測定儀：上海華巖儀器設(shè)備有限公司；P-2000旋光儀：日本分光株氏會(huì)社；FTS-135紅外光譜儀：美國Bio-Rad公司；240PC紫外分光光度儀：日本島津公司；VG AutoSpec-3000質(zhì)譜儀：英國VG公司；Bruker AV-400核磁共振儀：德國布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株形態(tài)鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：以PDA培養(yǎng)基通過插片培養(yǎng)，對轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行形態(tài)特征觀察，參考真菌鑒定手冊[16]進(jìn)行初步鑒定。

1.3.2 菌株分子鑒定

菌株的總DNA的提取用改良十六烷基三甲基溴化銨hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法[17]，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的質(zhì)量和濃度。PCR反應(yīng)體系（25μL）：DNATaq酶Mix，10μL；引物ITS45'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，2 μL；引物ITS5 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，2 μL；模板DNA，2 μL；純凈水，9 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30s；50℃退火30s；72℃延伸1.5min；72℃末端延伸10min；循環(huán)30次；4℃保存。

送Invitrogen公司進(jìn)行測序，用Blast軟件將測得的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性搜索，選用同源性比較高的典型菌株的ITS序列作為參比對象，采用鄰接法用MEGA 7軟件以ITS序列構(gòu)建鑒定菌株與參比菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 放大發(fā)酵培養(yǎng)

取斜面培養(yǎng)基上的菌絲接種入5瓶種子培養(yǎng)基，置于恒溫?fù)u床，溫度30℃，轉(zhuǎn)速220 r/min，培養(yǎng)5 d。

各配制5 L孕酮和4-AD轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基：每250 mL錐形瓶加入100 mL培養(yǎng)基，經(jīng)121℃滅菌鍋滅菌冷卻至室溫，將每10 mL種子培養(yǎng)基接種入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，置于恒溫?fù)u床，溫度30℃，轉(zhuǎn)速220 r/min，發(fā)酵7 d。

1.3.4 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的提取

發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)減壓抽濾，菌絲體用乙醇浸泡超聲提取3次，過濾、合并乙醇浸提液，減壓濃縮；濾液用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮。合并上述粗提物，得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的總提取物。

1.3.5 高效液相色譜分析檢測方法

色譜柱：Agilent XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；檢測器：二極管陣列檢測器；流動(dòng)相：甲醇∶水=41∶59（V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：243 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：5 μL。

1.3.6 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離與鑒定

將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物提取物用甲醇溶解，利用硅膠柱層析進(jìn)行分離，洗脫劑為石油醚/乙酸乙酯體系。轉(zhuǎn)化孕酮粗提物用200～300目的硅膠拌樣，通風(fēng)櫥下放置晾干，用200～300目硅膠柱層析，干法上樣，用石油醚和乙酸乙酯的不同體積比進(jìn)行梯度洗脫，石油醚與乙酸乙酯的體積比分別為：10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、0∶1，洗脫液濃縮真空抽干后用薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）檢測分析法分析，相同組分合并。轉(zhuǎn)化4-AD粗提物用200～300目硅膠柱層析，干法上樣，用石油醚和乙酸乙酯的不同體積比進(jìn)行梯度洗脫，石油醚與乙酸乙酯的體積比為：10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、0∶1，洗脫液濃縮真空抽干后，用TLC檢測分析法分析，相同組分合并。參考WU Y等[14-15]的方法，將分離得到的化合物以核磁共振、紅外光譜、質(zhì)譜分析等手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)化菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

以PDA培養(yǎng)基通過插片培養(yǎng)，對轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行形態(tài)特征觀察，該菌的菌落及菌絲形態(tài)見圖1。由菌株YNCA0116在PDA培養(yǎng)基生長5 d，菌落背面褐色、正面中間褐色邊緣白色，菌絲分隔，菌絲生于基質(zhì)內(nèi)，PDA培養(yǎng)基未產(chǎn)生孢子，在促孢培養(yǎng)基上也未產(chǎn)生孢子。初步鑒定菌株YNCA0116為刺盤孢屬（Colletotrichumsp.）。

圖1 菌株YNCA0116菌落及菌絲顯微形態(tài)Fig.1 Colony morphology and mycelium micromorphology of strainYNCA0116

2.2 菌株16S r RNA基因序列鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。

圖2 菌株YNCA0116 PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.2 PCR amplification electrophoretogram of strain YNCA0116

由圖2可知，菌株YNCA0116 PCR擴(kuò)增的ITS序列片段長度介于500～750 bp。ITS序列測序后進(jìn)行建樹分析，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，菌株YNCA0116與長直孢刺盤孢NR 145380.1ColletotrichumgigasporumCBS133266和KF687734.1Colletotrichum gigasporum CBS 181.52聚為一小簇，與多株刺盤孢屬菌株聚為一大簇，與長直孢刺盤孢NR 145380.1Colletotrichum gigasporumCBS 133266和KF687734.1Colletotrichum gigasporumCBS181.52相似度為100%，因此確定轉(zhuǎn)化菌株為刺盤孢屬（Colletotrichumsp.）。

圖3 菌株YNCA 0116的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain YNCA 0116 based on ITS sequence

2.3 高效液相色譜分析結(jié)果

對刺盤孢屬菌株YNCA0116轉(zhuǎn)化孕酮和4-AD發(fā)酵液的粗提物進(jìn)行高效液相色譜（high performance liquid chromatogram，HPLC）分析，結(jié)果分別見圖4和圖5。

圖4 無底物培養(yǎng)基（A）、孕酮標(biāo)準(zhǔn)品（B）及菌株YNCA 0116轉(zhuǎn)化孕酮發(fā)酵液（C）的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of non-substrate medium(A),progesterone standard(B)and progesterone fermentation liquid biotransformed by strain YNCA 0116(C)

圖5 4-AD標(biāo)準(zhǔn)品（A）及菌株YNCA 0116轉(zhuǎn)化4-AD發(fā)酵液（B）的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of 4-AD standard(A)and 4-AD fermentation liquid(B)biotransformed by strain YNCA 0116

由圖4可知，無底物培養(yǎng)基發(fā)酵在1.332 min出現(xiàn)培養(yǎng)基發(fā)酵的背景峰，孕酮出峰時(shí)間為14.014 min，孕酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物出現(xiàn)在3.685 min（峰Ⅰ）和3.969 min（峰Ⅱ），孕酮幾乎完全轉(zhuǎn)化。由圖5可知，4-AD出峰時(shí)間為28.253min，4-AD主要產(chǎn)轉(zhuǎn)化物出現(xiàn)在2.658 min（峰Ⅲ），4-AD幾乎完全轉(zhuǎn)化。

2.4 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

孕酮轉(zhuǎn)化提取物分離純化，得到化合物1和化合物2；4-AD轉(zhuǎn)化提取物分離純化，得到化合物3?；衔?、2和3經(jīng)核磁共振、質(zhì)譜、紅外光譜、紫外光譜分析，結(jié)構(gòu)如圖6。

圖6 菌株YNCA 0116轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)Fig.6 Structures of the transformation products of strain YNCA 0116

三種化合物的結(jié)構(gòu)解析如下：

化合物1：白色粉末，易溶氯仿、吡啶，微溶甲醇、乙酸乙酯，不溶石油醚和乙醚。比旋光度[α]25=+11.30°（CHOH）D3熔程：230～240℃。紫外光譜最大吸收波長243 nm，紅外光譜主要基團(tuán)頻率為3453cm-1、3132cm-1、2361cm-1、165cm-1、1456cm-1、1128cm-1。核磁共振碳譜化學(xué)位移為44.7（t，C-1），40.1（t，C-2），200.5（C=O，C-3），124.5（d，C-4），171.1（s，C-5），35.7（t，C-6），34.8（t，C-7），18.5（d，C-8），60.7（d，C-9），34.3 s，C-10），68.8（d，C-11），50.6（t，C-12），33.7（s，C-13），62.2 d，C-14），72.7（d，C-15），37.6（t，C-16），59.3（d，C-17），15.8 q，C-18），31.5（q，C-19），208.1（C=O，C-20），31.7（q，C-21）；核磁共振氫譜化學(xué)位移為5.74（1H，m，H-4），4.05（1H，m，H-11），4.06（1H，m，H-15），0.71（3H，s，H-18），1.16（3H，s，H-19），1.98（3H，s，H-21）。電噴霧質(zhì)譜顯示準(zhǔn)分子離子峰質(zhì)荷比為369[M+Na]+，分子式：C21H30O4。與文獻(xiàn)[18-19]對照一致，鑒定其結(jié)構(gòu)為：11α,15α-二羥基孕酮（11α,15α-dihydroxyprogesterone）。

化合物2：白色粒狀晶體，無味，易溶氯仿、吡啶，微溶甲醇、乙酸乙酯，不溶石油醚和乙醚。比旋光度[α]25=+4.6°DCH3OH），熔程：246～250℃。紫外光譜最大吸收波長243nm，紅外光譜主要基團(tuán)頻率為3 443 cm-1、3 373 cm-1、1 720 cm-1、1697cm-1、1659cm-1。核磁共振碳譜化學(xué)位移為39.4（t，C-1），37.7（t，C-2），200.8（C=O，C-3），127.2（d，C-4），168.0（s，C-5），73.3（d，C-6），44.4（t，C-7），20.3（d，C-8），59.1（d，C-9），28.5 s，C-10），69.0（d，C-11），50.6（t，C-12），39.2（s，C-13），55.5 d，C-14），31.4（t，C-15），23.1（t，C-16），63.3（d，C-17），18.5（q，C-18），24.3（q，C-19），208.5（C=O，C-20），34.5（q，C-21）；核磁共振氫譜化學(xué)位移為5.82（1H，m，H-4），4.11（1H，t，J=10.5Hz，H-11），4.35（1H，t，J=3Hz，H-6），0.66（3H，s，H-18），1.51（3H，s，H-19），1.91（3H，s，H-21）。質(zhì)譜顯示準(zhǔn)分子離子峰質(zhì)荷比為369[M+Na]+，與文獻(xiàn)[20]對照一致，鑒定其結(jié)構(gòu)為：6β,11α-二羥基孕酮（6β,11α-dihydroxyprogesterone）。

化合物3：白色粉末，易溶吡啶，微溶甲醇、乙酸乙酯、氯仿，不溶石油醚和乙醚。比旋光度[α]2D8=+222±1°（CHCl3），熔程：221～222℃。紫外光譜最大吸收波長243 nm，紅外光譜主要基團(tuán)頻率為3 388 cm-1、2 922 cm-1、1 736 cm-1、1 657 cm-1、1 302 cm-1。核磁共振氫譜化學(xué)位移為1.37（3H，s，H-18），1.39（3H，s，H-19），3.23（1H，m，H-15），3.21（1H，m，H-11），5.90（1H，s，H-4）。核磁共振碳譜化學(xué)位移為41.0（t，C-1），38.5（t，C-2），199.6（C=O，C-3），124.8（d，C-4），171.7（s，C-5），36.0（t，C-6），35.3（t，C-7），32.9（d，C-8），60.3（d，C-9），34.3（s，C-10），68.4（d，C-11），51.4（t，C-12），44.1（s，C-13），47.8（d，C-14），69.6（d，C-15），57.7（t，C-16），216.0（C=O，C-17），15.5（q，C-18），22.1（q，C-19），質(zhì)譜顯示準(zhǔn)分子離子峰質(zhì)荷比為339[M+Na]+，與文獻(xiàn)[21]對照一致，鑒定其結(jié)構(gòu)為：11β,15α-二羥基-4-雄烯二酮（11β,15α-dihydroxy-4-androstendione）。

3 結(jié)論

能轉(zhuǎn)化孕酮和4-AD的菌株YNCA0116為刺盤孢屬（Colletotrichumsp.）。

從菌株YNCA0116轉(zhuǎn)化孕酮的HPLC分析可以看出，孕酮被大部分轉(zhuǎn)化為11α,15α-二羥基孕酮，轉(zhuǎn)化專一性較好，極少部分轉(zhuǎn)化為6β,11α-二羥基孕酮。在HPLC圖上幾乎看不到底物，表明轉(zhuǎn)化完全，以后的工作中將嘗試用發(fā)酵罐進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究。為實(shí)現(xiàn)更為專一的轉(zhuǎn)化，需通過轉(zhuǎn)化過程的優(yōu)化，減少或消除6β,11α-二羥基孕酮的生成。

從菌株YNCA0116轉(zhuǎn)化4-AD的HPLC分析可以看出，4-AD被大部分轉(zhuǎn)化為11β,15α-二羥基-4-雄烯二酮，轉(zhuǎn)化專一性較好，未分離出其它轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。在HPLC圖上幾乎看不到底物，表明轉(zhuǎn)化完全，以后的工作中將嘗試用發(fā)酵罐進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究。

刺盤孢屬菌株YNCA0116轉(zhuǎn)化孕酮和4-AD都得到二羥基產(chǎn)物，引入15α羥基的立體選擇性，但11位羥基化時(shí)，孕酮為α構(gòu)型，4-AD為β構(gòu)型。本研究尚需以該菌株對更多的甾體化合進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究，并深入研究轉(zhuǎn)化機(jī)理，以明確該菌株轉(zhuǎn)化甾體化合物的特點(diǎn)，為甾體藥物的研究和開發(fā)提供更多的選擇。

[1]BHATTI H N,KHERA R A.Biological transformations of steroidal compounds:a review[J].Steroids,2012,77(12):1267-1290.

[2]MAO S,ZHANG L,GE Z,et al.Microbial hydroxylation of steroids byPenicillium decumbens[J].J Mol Catal B-Enzyma,2017,online.

[3]DONOVA M V,EGOROVA O V.Microbial steroid transformations:current state and prospects[J].Appl Microbiol Biot,2012,94(6):1423-1447.

[4]GIRVAN H M,MUNRO A W,Applications of microbial cytochrome P450 enzymes in biotechnology and synthetic biology[J].Curr Opin Chem Biol,2016,31:136-145.

[5]HUNTER AC,COYLE E,MORSE F,et al.Transformation of 5-ene steroids by the fungusAspergillus tamariiKITA:mixed molecular fate in lactonization and hydroxylation pathways with identification of a putative 3beta-hydroxy-steroid dehydrogenase/Delta5-Delta4 isomerase pathway[J].BBA-Mol Cell Biol Lipid,2009,1791(2):110-117.

[6]KOLEK T,SZPINETER A,S′WIZDOR A.Baeyer-Villiger oxidation of DHEA,pregnenolone,and androst enedione byPenicillium lilacinumAM111[J].Steroids,2008,73(14):1441-1445.

[7]MAO S,YU L,JI S,et al.Evaluation of deep eutectic solvents as cosolvent for steroids 1-endehydrogenation biotransformation byArthrobacter simplex[J].J Chem Technol Biot,2016,91(4):1099-1104.

[8]HAMZEH,KIYANI,MARYAM,et al.Potassium phthalimide:An efficient and green organocatalyst for the synthesis of 4-aryl-7-(arylmethylene)-3,4,6,7-tetrahydro-1H-cyclopenta[d]pyrimidin-2(5H)-ones]thiones under solvent-free conditions[J].Chinese Chem Lett,2014,25(2):313-316.

[9]SHEN Y,MA B,ZHENG Y,et al.The mechanism of β-cyclodextrin on the 11β-hydroxylation biotransformation of steroid[C].Yantai:International Conference on Biomedical Engineering and Informatics,2010.

[10]LIANG Q K,WANG J M,SHEN Y B,et al.Microbioligcal transformation of bavachinin byPenicillium raistrickiiATCC10490[J].Pharm Biotechnol,2012,19(3):218-221.

[11]BERRIE J R,WILLIAMS R A,SMITH K E.Microbial transformations of steroids-XII.Progesterone hydroxylation profiles are modulated by post-translational modification of an electron transfer protein inStreptomycesroseochromogenes[J].J Steroid Biochem Mol Biol,2001,77(1):87-96.

[12]ARUNRATTIYAKORN P,SUWANNASAI N,AREE T,et al.Biotransformation of α-mangostin byColletotrichumsp.MT02 andPhomopsis euphorbiaeK12[J].J Mol Cata B-Enzym,2014,102:174-179..

[13]NUMPAQUE M A,GONZALEZ J H G,LUIS D,et al.Biotransformation of ferulic acid by the phytopathogenic fungiColletotrichum acutatumandLasiodiplodia theobromae[J].Revfacnalagrmedellín,2016,69(1):7835-7844.

[14]WU Y,LI H,ZHANG X M,et al.Efficient hydroxylation of functionalized steroids byColletotrichum liniST-1[J].J Mol Cata B-Enzym,2015,120:111-118.

[15]LI C,LI H,SUN J,et al.Production of 7α,15α-diOH-DHEA from dehydroepiandrosterone byColletotrichum liniST-1 through integrating glucose-feeding with multi-step substrate addition strategy[J].Bioproc Biosyst Eng,2016,39(8):1259-1266.

[16]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979：91-100.[17]黃 芳，韓 婷，奉路平.牡荊內(nèi)生真菌的分離鑒定[J].中國中藥雜志，2011，36（14）：1945-1950.

[18]BRYAN M B,SCOTT A P,CERNY I,et al.15Alpha-hydroxyprogesterone in male sealampreys,Petromyzon marinusL[J].Steroids,2004,69(7):473-481.

[19]FARAMARZI M A,TABATABAEI Y M,AMINI M,et al.Microbial hydroxylation of progesterone withAcremonium strictum[J].FEMS Microb Lett,2003,222(2):183-186.

[20]CHOUDHARY M I,BATOOL I,SHAH S A,et al.Microbial hydroxylationofpregnenolonederivatives[J].Chem Pharm Bull(Tokyo),2005,53(11):1455-1459.

[21]MOHAMMAD A F,MOJTABA TY,HODA J,et al.Studies on the microbial transformation of androst-1,4-dien-3,17-dione withAcremonium strictum[J].J Ind Microbiol Biot,2006,33(9):725-733.