乳酸克魯維酵母常溫常壓等離子體誘變選育及其突變株整細胞催化特性

曹 綱，劉 云，郭金玲，呂育財，余華順，龔大春*

（1.三峽大學(xué) 生物催化重點實驗室，湖北 宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司 酶制劑事業(yè)部，湖北 宜昌 443002）

手性苯乙醇是合成β2受體激動劑R-沙丁胺醇（R-salbuamol）、R，R-福莫特羅（R,R-formoterol）和R-沙美特羅（R-salmeterol），β2受體激動劑R-異丙腎上腺類和R-地諾帕明R-denopamine）等手性藥物的關(guān)鍵中間體[1]。這些手性藥物是臨床中治療哮喘、心律失常和心力衰竭等疾病的有效藥物，但過去主要采用化學(xué)拆分[2]和化學(xué)不對稱方法[3]制得，存在生產(chǎn)條件苛刻、收率低、對應(yīng)選擇性不高等問題，而生物催化具有綠色、高效的突出優(yōu)勢，采用整細胞或酶來制取該類化合物成為一種趨勢[4-7]。手性苯乙醇目前主要是采用假絲酵母[8]、解脂耶氏酵母[9]和面包酵母[10]催化制備，但存在細胞生長慢、底物容量?。?2 g/L以下）、制備效率偏低（轉(zhuǎn)化率在70%以下）等問題[11]。

本研究采用常壓常溫等離子體誘變儀（atomspheric oom temperature plasma，ARTP）對乳酸克魯維酵母進行誘變，以耐20 g/L的苯乙酮毒性和酮基還原酶酶活作為篩選標記，旨在獲得高產(chǎn)酮基還原酶、轉(zhuǎn)化能力強的菌株，為乳酸克魯維酵母細胞催化苯乙酮制備手性苯乙醇的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）2.1494：中國普通微生物菌種保藏管理中心；由本實驗室保藏于4℃冰箱中。

苯乙酮（分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；醋酸乙酯（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；正己烷、異丙醇（均為色譜純）：美國Avantor Performance Materials公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）（生化試劑）：上海前塵生物科技有限公司；三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸鹽（Tris（hydroxymethyl）aminomethane-HCl，Tris-HCl）：美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ARTP-M常壓常溫等離子體誘變儀（ARTP）誘變儀：無錫源清天木生物科技有限公司；LC5090高效液相色譜儀（highperformanceliquidchromatography，HPLC）：浙江福立分析儀器股份有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；CHIRALCEL OB-H手性柱：日本Daicel公司。

1.3 方法

1.3.1 斜面和平板培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，瓊脂粉20 g/L，滅菌20 min。

標準培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，滅菌20 min。

初篩培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L，蔗糖23.8 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，七水合硫酸鎂1.5 g/L，苯乙酮20 g/L，滅菌20 min。

1.3.2 種子培養(yǎng)及發(fā)酵方法

菌種活化：利用YEPD培養(yǎng)基制備好平板或斜面培養(yǎng)基接種，28℃恒溫培養(yǎng)36 h以復(fù)蘇菌種。

種子培養(yǎng)：挑取適量活化好的平板或斜面菌種的單菌落，接種到裝有100mL發(fā)酵液的錐形瓶中，放入搖床，30℃、200 r/min培養(yǎng)36 h。

發(fā)酵培養(yǎng)及整細胞轉(zhuǎn)化：將培養(yǎng)好的種子液按4%接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min培養(yǎng)24 h或48 h。

1.3.3 ARTP的誘變方法

將出發(fā)菌株培養(yǎng)到一定濃度，從波長600 nm處的光密度（optical density，OD）OD600nm=1的菌液中取10 μL稀釋至10-6，采用ARTP誘變育種系統(tǒng)，輻射功率120 W，改變不同的誘變時間，分別照射0、15 s、30 s、45 s、60 s、90 s、120 s、150 s和180 s，將載片放于裝有1 mL生理鹽水的離心管中，振蕩均勻后稀釋至10-1、10-2、10-33個梯度，每個梯度涂布2個平板后放入28℃恒溫培養(yǎng)36 h后，計算菌體數(shù)量和致死率，繪制致死率曲線，確定適宜照射時間。在適宜照射時間下，建立產(chǎn)乳酸克魯維酵母的等離子體誘變突變庫，挑取存活單菌落制作甘油管，于超低溫冷凍保存，備初篩、復(fù)篩用。

1.3.4 酮基還原酶的酶活定義及測定方法

酮基還原酶活定義：每1 min催化還原1 mol底物苯乙酮的酶活力為1個酶活單位（U）。

酮基還原酶提?。菏占l(fā)酵菌液，10 000 r/min離心10 min，收集濕菌體；按1∶10的濕菌體（g）/Tris-鹽酸緩沖液（mL）的比例混合，用超聲波破壁儀（400 W，每破碎10 s間歇20 s）冰浴破碎0.5 h，離心取上清，備用。

酮基還原酶測定方法[12]：將0.02 mol/L的NADH的溶液（100 μL）、0.03 mol/L的苯乙酮（100 μL）和pH=8的緩沖液Tris-HCl（700μL）加至1mL比色皿中，于30℃放置2min；加入酮基還原酶的粗酶液（100μL），然后每隔20s觀察記錄OD340nm值，觀察記錄2min，計算斜率EW，測定轉(zhuǎn)化底物苯乙酮的酶活。酶活計算公式為EW×V×103/（6220×l），其中V為反應(yīng)液的體積1mL，EW為1min內(nèi)波長340nm處吸光度值的變化斜率（取絕對值），6220是摩爾消光系數(shù)[L·（mol·cm）-1]，l為光程距離（cm）。

1.3.5 高產(chǎn)突變株篩選方法

初篩：根據(jù)前期出發(fā)菌株的整細胞催化研究[13]，確定篩選所用底物苯乙酮濃度為20 g/L。將保存的單菌落接種到含有20 g/L苯乙酮的發(fā)酵培養(yǎng)基中，12 h后檢測菌濃。記錄菌濃OD600nm值單菌落甘油管，并編號，然后進行轉(zhuǎn)接、發(fā)酵培養(yǎng)，取濕菌超聲破碎，測定酮基還原酶酶活，對酶活增加或減少10%、20%、30%、40%、50%、60%的菌株進行編號保藏。

復(fù)篩：將初篩的酶活增加60%以上的突變菌株接種到轉(zhuǎn)化含有苯乙酮20 g/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，對完成整細胞催化的溶液用醋酸乙酯（100 mL×3）萃取3次，合并有機相，用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸餾，得到反應(yīng)液，用正己烷定容，采用HPLC檢測出苯乙酮殘余量，計算苯乙酮的轉(zhuǎn)化率。根據(jù)轉(zhuǎn)化率大小確定優(yōu)勢菌株。

1.3.6 色譜條件及各指標測定方法[14]

色譜條件：CHIRALCELOB-H手性柱（4.6mm×250mm，5 μm）；流動相正己烷：異丙醇（90∶10，V/V）；檢測波長220 nm；流速0.5 mL/min；柱溫30℃。

菌株致死率（是指菌株經(jīng)過誘變后發(fā)生死亡的百分率）、突變標準（是為了獲得高產(chǎn)酮基還原酶的突變株所規(guī)定的一個增加比率）、正負突變率、苯乙酮轉(zhuǎn)化率計算公式如下：

1.3.7 篩選得到的優(yōu)勢突變株的生長特性

利用復(fù)篩得到的優(yōu)勢突變株進行生長曲線測定，考察該菌株和出發(fā)菌株的生長特性變化；根據(jù)課題組文獻[12]前期試驗，按照等摩爾碳使用量原則，設(shè)計表1研究方案，200 r/min，培養(yǎng)溫度為30 ℃，發(fā)酵24 h后，通過OD600nm值測定菌體濃度，并用干質(zhì)量法測定實際菌體質(zhì)量，考察最優(yōu)突變株對葡萄糖、蔗糖等不同碳源的利用能力，為整細胞催化特性研究奠定基礎(chǔ)。

表1 不同碳源對乳酸克魯維酵母及其突變株生長的影響Table 1 Effects of different carbon sources on the growth ofK.lactisand its mutant straing/L

表2 不同氮源對乳酸克魯維酵母及其突變株生長的影響Table 2 Effect of different nitrogen sources on the growth ofK.lactisand its mutant straing/L

選擇酵母浸膏、牛肉膏等六種氮源，設(shè)計表2方案進行試驗，200 r/min、30 ℃條件下發(fā)酵24 h后，通過OD600nm值測定菌體濃度，并用干質(zhì)量法測定實際菌體質(zhì)量，考察乳酸克魯維酵母突變株對氮源的利用情況。

1.3.8 不同因素對突變株整細胞催化特性的影響

選取E1-E4四種不同補料催化方式對最佳碳源、最佳氮源、磷酸二氫鉀及七水合硫酸鎂用量5個因素4個水平進行16次正交試驗，因素與水平見表3，以底物苯乙酮轉(zhuǎn)化率為評價指標，在28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，考察不同因素水平對最優(yōu)突變株KL5整細胞催化特性的影響。

表3 突變株KL5整細胞催化條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 3 Factors and levels of orthogonal experiments for catalysis conditions optimization of the whole cell of mutant strain KL5

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP處理時間的選擇

ARTP等離子體誘變技術(shù)是我國清華大學(xué)邢新會團隊發(fā)明的一種新型的菌種快速誘變方法。等離子體誘變過程中會生產(chǎn)超氧自由基、羥基自由基等20多種活性物質(zhì)[15]。這些活性物質(zhì)與微生物的DNA作用位點結(jié)合，誘導(dǎo)DNA斷裂。由于不同的活性物質(zhì)作用于DNA的位點不同，造成的氧化損傷、基因突變的偏好性也會有所差異[16]。按照1.3.3所敘述的方法試驗，在不同誘變時間下得到誘變菌株，制備相應(yīng)平板，結(jié)果見圖1。由圖1可知，等離子體誘變儀釋放出來的等離子體對乳酸克魯維酵母損傷特別大，20s有70.0%左右的菌株死亡，而30 s即可達到98.6%的致死率，考慮到乳酸克魯維酵母的生長繁殖快的特點，適當延長處理時間，有利于提高突變體質(zhì)量，因此本試驗選取ARTP處理120 s、致死率在98.0%～99.5%期間的單菌落進行篩選試驗。

圖1 乳酸克魯維酵母致死率曲線Fig.1 Lethality curve ofK.lactis

2.2 ARTP誘變高產(chǎn)突變株選育

2.2.1 突變株性能的初步篩選

針對文獻報道酵母整細胞催化耐底物能力不強、轉(zhuǎn)化率不高等問題，采用在培養(yǎng)基添加底物苯乙酮，通過12 h獲得生物量高低和突變體菌株的酮基還原酶酶活變化作為篩選標記，采用1.3.3和1.3.4的方法進行培養(yǎng)和酶活測定，對等離子體誘變的乳酸克魯維酵母突變體庫進行初篩。根據(jù)與出發(fā)菌株相比所增加10%～60%的酮基還原酶作為突變標準，對所得到的系列突變體庫的菌株進行分類整理，結(jié)果見表4。

表4 不同突變標準下正負突變率變化情況Table 4 Changes of positive and negative mutation rate under different mutation standards

由表4可知，菌種突變是隨機的，以酮基還原酶酶活高低為依據(jù)，隨著突變標準的提高，在獲得的200株突變體庫中正突變概率逐漸低于負突變概率，與文獻[17]觀察一致。所以利用ARTP誘變儀對出發(fā)菌株誘變，突變標準越高越難得到突變菌株。通過系列挑選，得到突變標準＞30%的5株菌株（編號分別為KL1、KL2、KL3、KL4、KL5）。將其和出發(fā)菌株一起在28℃、200 r/min進行苯乙酮轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)24 h，分別考察其苯乙酮轉(zhuǎn)化率及酮基還原酶酶活，結(jié)果見表5。

表5 乳酸克魯維酵母產(chǎn)酮基還原酶較優(yōu)突變株的初篩結(jié)果Table 5 Preliminary screening results of superior ketoreductaseproducing mutant strains fromK.lactis

由表5可知，發(fā)酵24 h后苯乙酮的轉(zhuǎn)化率，與菌株的酮基還原酶酶活成正相關(guān)性，酮基還原酶酶活和苯乙酮轉(zhuǎn)化率的變化趨勢具有一致性，與出發(fā)菌株KL相比，突變菌株KL1～KL5酮基還原酶分別提高36%、47%、91%、115%和132%，苯乙酮轉(zhuǎn)化率分別提高32%、34%、87%、123%和148%。結(jié)果表明通過誘變后，有效提高乳酸克魯維酵母產(chǎn)酮基還原酶的能力。

2.2.2 較優(yōu)突變株的復(fù)篩實驗

為了驗證突變株的發(fā)酵實驗結(jié)果，對初篩中酮基還原酶較高的5株突變株KL1、KL2、KL3、KL4、KL5和出發(fā)菌株連續(xù)進行2次生物催化實驗，結(jié)果見表6。由表6可知，這5株菌生物催化特性穩(wěn)定和平行性較好，其生物轉(zhuǎn)化趨勢基本一致。復(fù)篩后，菌株KL4和KL5對苯乙酮轉(zhuǎn)化率分別提高123%和150%。

表6 較優(yōu)突變株的復(fù)篩結(jié)果Table 6 Rescreening results of superior mutant strains

2.2.3 突變株遺傳穩(wěn)定性實驗

分別將篩選得到的KL1-KL5五株菌在28℃、200 r/min進行苯乙酮轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)24 h，結(jié)果見表7。由表7可知，通過初篩和復(fù)篩篩選出的5株突變菌株較出發(fā)菌株整細胞催化苯乙酮轉(zhuǎn)化率可提高30%～160%，并通過傳代4～6次穩(wěn)定性試驗的結(jié)果表明菌株KL4對苯乙酮轉(zhuǎn)化率穩(wěn)定在35%～36%之間，而菌株KL5對苯乙酮轉(zhuǎn)化率穩(wěn)定在39%～41%之間。等離子誘變的乳酸克魯維酵母突變菌株都有著良好的遺傳穩(wěn)定性。

表7 較優(yōu)突變株遺傳穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 7 Genetic stability experiments results of superior mutant strains

2.3 突變株KL5生長特性及整細胞催化特性

2.3.1 突變株KL5與出發(fā)菌株生長特性比較

以復(fù)篩最好的乳酸克魯維酵母KL5進行實驗，考察其菌株生長特性，結(jié)果見圖2。由圖2可知，突變菌株和出發(fā)菌株的生長規(guī)律基本相同，但是突變菌株KL5在對數(shù)生長期10～20 h之間生長得更快，OD600nm值從3增加到16左右，而原始菌株在相關(guān)培養(yǎng)時間內(nèi)，OD600nm值只有突變菌株的一半[12]。乳酸克魯維細胞里的酮基還原酶為胞內(nèi)酶，本研究通過測定酮基還原酶酶活，表明其酶活與菌體生物量呈正相關(guān)，說明等離子體物理誘變可能是改變了菌體生長的控制基因，從而提高酮基還原酶酶活。因此經(jīng)ARTP誘變儀誘變后篩選得到的誘變菌株在生長特性上比出發(fā)菌株將更適合生物轉(zhuǎn)化苯乙酮。

圖2 出發(fā)菌和突變菌KL5的生長曲線Fig.2 Growth curves of the starting strain and mutant strain KL5

2.3.2 突變株KL5對不同碳源、氮源的利用特性

選擇葡萄糖、乳糖等5種主要碳源，其他培養(yǎng)基不變，按照表1設(shè)計在30℃、200 r/min進行培養(yǎng)發(fā)酵24 h后測得不同培養(yǎng)基菌體的干質(zhì)量，結(jié)果見圖3。由圖3可知，突變株KL5和出發(fā)菌株一樣，添加蔗糖培養(yǎng)的菌體干質(zhì)量可達到0.18g，而乳糖培養(yǎng)得到的菌體干質(zhì)量僅為0.04 g。對5種主要碳源利用效果最好的是蔗糖，葡萄糖次之，對乳糖利用效果最差，因此選用蔗糖為最佳碳源。

圖3 突變菌株KL5在不同種類碳源條件下菌體干質(zhì)量Fig.3 Dry mass of the mutant strain KL5 under the different carbon sources conditions

選用蔗糖為碳源，其他培養(yǎng)條件不變，選擇酵母浸膏、牛肉膏等六種氮源進行試驗，結(jié)果見圖4。由圖4可知，酵母浸粉和酵母膏都很適合乳酸克魯維酵母的生長，培養(yǎng)溫度為30℃、200r/min培養(yǎng)24h后測得菌體干質(zhì)量可以達到0.6g左右，而利用硫酸銨，培養(yǎng)誘變菌株，24h所得菌體不到0.1g?？紤]到酵母膏含水量太高導(dǎo)致相同質(zhì)量營養(yǎng)性能比酵母浸粉略差，因此選用酵母浸粉作為乳酸克魯維酵母突變株KL5的最佳氮源。

圖4 突變菌株KL5在不同種類氮源條件下菌體干質(zhì)量Fig.4 Dry mass of the mutant strain KL5 under the different nitrogen sources conditions

2.3.3 突變株KL5整細胞催化特性正交試驗優(yōu)化

在單因素試驗基礎(chǔ)上，對突變株KL5主要影響因素蔗糖、酵母浸膏、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等用量和底物苯乙酮補料方式按照正交試驗方法考察整細胞催化特性。正交試驗結(jié)果與分析見表8。

由表8可知，突變株KL5整細胞催化受底物苯乙酮的補料方式影響最大，其次是碳源、七水合硫酸鎂、磷酸二氫鉀，影響最小的是氮源，其中前4個因素均對試驗具有顯著性的影響，F(xiàn)比均＞F臨界值（a=0.05）。試驗發(fā)現(xiàn)一次補料底物的轉(zhuǎn)化率比分次添加還高，這說明通過誘變，突變株的耐毒性得到提高。在底物苯乙酮的質(zhì)量濃度為20 g/L條件下，最優(yōu)催化條件組合為A1B2C2D1，即蔗糖22.0 g/L，酵母浸粉10.0 g/L，磷酸二氫鉀3.0 g/L，七水合硫酸鎂1 g/L，補料方式為一次添加。以此最優(yōu)催化條件利用突變株KL5進行4次驗證催化驗證試驗，苯乙酮轉(zhuǎn)化率平均達到91.8%，與預(yù)測一致比優(yōu)化前出發(fā)菌株轉(zhuǎn)化率提高2.5倍。

表8 突變株KL5整細胞催化條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 8 Results and analysis of orthogonal experiments for the whole cell catalysis conditions optimization of the mutant strain KL5

3 結(jié)論

采用常溫常壓等離子體（ARTP）誘變方法，以耐20 g/L的苯乙酮毒性和酮基還原酶酶活作為篩選標記，對乳酸克魯維酵母進行選育得到高產(chǎn)酮基還原酶的突變菌株KL5，研究了該菌株的生長特性及對底物苯乙酮轉(zhuǎn)化能力，在底物苯乙酮的質(zhì)量濃度達到20 g/L，蔗糖22.0 g/L，酵母浸粉10.0 g/L，磷酸二氫鉀3.0 g/L，七水合硫酸鎂1 g/L，補料方式為一次添加的條件下28℃、200 r/min轉(zhuǎn)化48 h，可以實現(xiàn)苯乙酮轉(zhuǎn)化率91.8%，比出發(fā)菌株提高2.5倍。該菌株具有廣闊的生物催化應(yīng)用前景，后期將對其突變的內(nèi)在機理開展分子生物學(xué)研究，為酮基還原酶的蛋白質(zhì)工程改造提供指導(dǎo)。

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