產(chǎn)黃青霉、扣囊復(fù)膜孢酵母替代部分大曲提高食醋原料利用率

張 琪，王靜慧，花 錦，王如福，侯紅萍，霍乃蕊*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801；2.山西出入境檢驗檢疫局，山西 太原 030000；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 晉中 030801）

山西老陳醋位列中國四大名醋之首[1]，其大曲以大麥、豌豆為原料，經(jīng)粉碎加水?dāng)嚢瑁葔撼汕?，在特定制曲環(huán)境中經(jīng)自然接種而成，富含多種細(xì)菌、霉菌、酵母菌等微生物[2]，是酒精發(fā)酵階段的主要糖化發(fā)酵劑[3]。GB/T 19777—2013《地理標(biāo)志產(chǎn)品山西老陳醋》[4]規(guī)定大曲用量＞62.5%時，可生產(chǎn)pH 3.6～3.9，總酸度為6度以上，不用添加任何防腐劑，可長時間保存，無保質(zhì)期的山西老陳醋。然而制曲約需21天，從原料到淋出醋也需要20多天，再經(jīng)至少1年的陳釀，因此生產(chǎn)周期較長，以曲代糧更加劇了其成本。因此應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)掘、優(yōu)化、規(guī)范山西老陳醋傳統(tǒng)工藝已被提到議事日程，相關(guān)學(xué)者及企業(yè)家已在菌種強化[5-7]、利用酶工程技術(shù)[8]等方面對老陳醋的傳統(tǒng)工藝進(jìn)行了改良，藥五忠[9]在釀醋原料液化階段添加淀粉酶，糖化階段添加糖化酶和紅曲，酒化階段僅添加40%～50%的大曲和固定化酵母液，減少大曲用量的同時，提高原料利用率，降低成本，增加效益，但其操作繁瑣，限制大量微生物的代謝，影響各種香氣成分和功能性成分的釋放和積累。

麩曲是以麩皮為主要原料，蒸熟后接入純種霉菌，在人工控溫控濕條件下培養(yǎng)的散曲[10-11]。釀制老陳醋所用的原輔料均含有大量的淀粉和纖維素[12]，因此，采用高產(chǎn)糖化酶和纖維素酶的菌種對提高原料利用率至關(guān)重要。

本研究以酒精度為評價指標(biāo)，無需添加外源催化劑，從微生物學(xué)角度對傳統(tǒng)釀醋工藝進(jìn)行改良，將菌株制成麩曲，篩選共發(fā)酵菌株，將篩選出的菌株與大曲共發(fā)酵，確定最優(yōu)配比，以期減少大曲用量，提高原料利用率，為實際生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米粉、高粱粉、麩皮、稻殼、釀酒酵母、麩曲培養(yǎng)基：均由山西太谷某醋廠提供。

菌株AS3.4309（M0）：山西太谷某醋廠生產(chǎn)快曲的菌株。課題組先期從發(fā)酵24 h的酒醅中分離篩選出高產(chǎn)糖化酶菌株，酶活力大小為菌株M6＞M5＞M8＞M15＞M2＞M0；高產(chǎn)纖維素酶菌株，酶活力大小為菌株M4＞M2＞M8＞M15，而菌株M0不產(chǎn)纖維素酶[13]。經(jīng)中科院微生物研究所鑒定，菌株M4為產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum），菌株M8為扣囊復(fù)膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera），現(xiàn)保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（China general microbiological culture collection center，CGMCC），菌種保藏編號分別為12375和12408。

1.2 儀器與設(shè)備

STARTER3100型pH計：奧豪斯儀器（上海）有限公司；HFsafe.1200LC型生物安全柜：上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 各試驗菌株麩曲的制作

麩皮、稻殼、水的質(zhì)量之比20∶1∶16，拌勻，121 ℃滅菌15 min，取出后趁熱打散，冷卻至30℃。分別接種3 mL各菌株（M0、M2、M4、M5、M6、M8、M15）孢子懸液或菌懸液（107個/mL）于麩曲培養(yǎng)基上，攪拌均勻，30℃培養(yǎng)12～15 h至長出白色菌絲，再扣瓶培養(yǎng)2～5 h，至表面布滿白色菌絲或產(chǎn)生少量孢子時取出，置于4℃冰箱中備用。

1.3.2 最佳料水比的確定

根據(jù)某醋廠實際生產(chǎn)工藝，取80 g玉米粉，設(shè)定料水比1∶3、1∶4、1∶5（g∶mL），室溫潤料12 h，蒸1 h，冷卻后加玉米粉40%的大曲與麩曲（2∶1），酵母0.06%，25℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。前3d每天攪拌一次，第3天攪拌完后用雙層塑料布封口，25℃繼續(xù)培養(yǎng)4 d，第8天測定酒精度。

1.3.3 大曲用量的確定

設(shè)定玉米粉為80 g，大曲用量為玉米粉的20%、30%、40%、50%，料水比為1∶3（g∶mL），酵母0.06%，不加麩曲，25℃發(fā)酵7 d，第8天測定酒精度。

1.3.4 大曲與麩曲添加比例的確定

某醋廠實際生產(chǎn)工藝中，大曲與M0麩曲的添加量比例約為1∶1。為進(jìn)一步優(yōu)化工藝，以M0麩曲為代表，設(shè)定料水比1∶3（g∶mL），大曲與麩曲的添加總量為玉米粉的40%，添加比例為1∶0、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3。

1.3.5 共發(fā)酵優(yōu)勢菌株的篩選

將各菌株制成麩曲替代部分大曲發(fā)酵：玉米粉80 g，料水比1∶3（g∶mL），大曲與麩曲的添加總量為玉米粉的40%，添加比例為2∶1，酵母0.06%，25 ℃發(fā)酵7 d，第8天測定酒精度，篩選共發(fā)酵的優(yōu)勢菌株。

1.3.6 優(yōu)勢菌株與大曲共發(fā)酵

（1）菌株M4、M8麩曲最佳添加比例的確定

將菌株M4和M8制成麩曲，與大曲按一定比例接種于酒精發(fā)酵液中，由Minitab16混料回歸設(shè)計確定三者的添加比例，玉米粉80 g、料水比1∶3（g∶mL），大曲與麩曲的添加總量為玉米粉的40%，添加比例為2∶1，酵母0.06%，25℃發(fā)酵7 d，第8天測定酒精度。

（2）M4、M8麩曲最佳添加比例下的發(fā)酵試驗

以上酒精發(fā)酵中原料均為玉米粉，但傳統(tǒng)山西老陳醋生產(chǎn)原料多為高粱，故分別以玉米粉、玉米粉和高粱粉（3∶7）、高粱粉為原料做發(fā)酵試驗。80 g玉米粉，料水比1∶3（g∶mL），大曲25.1%，菌株M4麩曲8.09%，菌株M8麩曲6.81%，25℃發(fā)酵7 d，第8天測酒精度。再進(jìn)行醋酸發(fā)酵，主料、稻殼、麩皮按12∶15∶20混勻，接入16.67%發(fā)酵24 h的醋醅，25 ℃培養(yǎng)。待溫度升到40℃左右時翻醅，每天翻醅1～2次，發(fā)酵16 d。加入5%的食鹽和2倍醋醅總質(zhì)量的水，泡24 h，淋醋（分兩次進(jìn)行，第一次加7成水泡12 h，淋出頭醋，第二次加3成水泡12 h，再淋出）。將兩次淋出的醋進(jìn)行混合，測定醋的質(zhì)量指標(biāo)。因試驗條件限制，不進(jìn)行熏醅。

1.3.7 指標(biāo)測定

（1）各項質(zhì)量指標(biāo)的測定

總酸、不揮發(fā)性酸、可溶性無鹽固形物、還原糖、總酯、氨基態(tài)氮均參照GB/T 19777—2013《地理標(biāo)志產(chǎn)品山西老陳醋》[4]的測定方法測定。酒精度的測定采用酒精計法。

（2）原料利用率的測定

總料按發(fā)酵原料、輔料和填充料的比例配制，醋糟在80℃烘干，參照GB 18187—2000《釀造食醋》[6]的方法分別測定總料、醋糟還原糖的含量，原料利用率的計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 料水比對酒精度的影響

為提高原料利用率，須選擇合適的料水比，為微生物的生長代謝和產(chǎn)酶提供最有利的環(huán)境[13]。試驗中不同料水比發(fā)酵條件下，各菌株的酒精發(fā)酵液酒精度見圖1。

由圖1可知，料水比為1∶3（g∶mL）時，發(fā)酵料液的酒精度最高，且接種菌株M8、M6和M4麩曲的發(fā)酵液酒精度顯著高于M0麩曲（P＜0.05）。加水量較高時，底物濃度較低，不利于菌株的生長和代謝。根據(jù)劉忠義等[14]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，料水比低于1∶3（g∶mL）時，發(fā)酵料液太稠，不利于酒精發(fā)酵，故選擇最佳的料水比為1∶3（g∶mL）。

圖1 不同料水比對酒精度的影響Fig.1 Effect of different material to water ratio on alcohol content

2.2 大曲用量對酒精度的影響

大曲中含多種菌類，是釀制老陳醋重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，大曲用量的多少至關(guān)重要[15]，大曲用量對酒精度的影響見圖2。

圖2 大曲用量對酒精度的影響Fig.2 Effect of Daqu addition on alcohol content

由圖2可知，酒精度隨著大曲用量的增加，呈先升高后降低的趨勢，大曲用量為40%時顯著高于其余各組P＜0.05），為10.1%vol。大曲用量較少時，會使酒精發(fā)酵不完全或發(fā)酵周期延長；較高時，不利于微生物生長代謝，故選擇大曲最佳用量為40%。

2.3 大曲與麩曲添加比例對酒精度的影響

大曲與麩曲添加比例對酒精度的影響見圖3。

圖3 大曲與麩曲添加比例對酒精度的影響Fig.3 Effect of the proportion of Daqu and Fuqu on alcohol content

由圖3可知，大曲和麩曲的添加比例為2∶1時，酒精發(fā)酵的酒精度接近于只加40%大曲的酒精度，差異不顯著（P＞0.05），其余添加比例與只加40%大曲的酒精度差異顯著（P＜0.05）。故設(shè)定以下試驗中大曲與麩曲添加比例為2∶1。

2.4 共發(fā)酵優(yōu)勢菌株的篩選

各菌株與大曲共發(fā)酵對酒精度影響的結(jié)果見圖4。由圖4可知，菌株M4、M6和M8麩曲與大曲發(fā)酵后的酒精度均顯著高于菌株M0麩曲（P＜0.05），菌株M8麩曲酒精度最高，分析原因可能是菌株本身就可利用葡萄糖生成酒精，且其產(chǎn)糖化酶活力較高，使葡萄糖轉(zhuǎn)化率提高。由于菌株M4麩曲產(chǎn)纖維素酶能力最強，而菌株M6麩曲不產(chǎn)纖維素酶，故選取菌株M8和M4麩曲用作混合發(fā)酵菌株。

圖4 菌株強化麩曲與大曲共發(fā)酵對酒精度的影響Fig.4 Effect of co-fermentation with strain fortified Fuqu and Daqu on alcohol content

2.5 優(yōu)勢菌株與大曲共發(fā)酵

2.5.1 菌株M4、M8麩曲最佳添加比例的確定

大曲與麩曲最佳添加比例2∶1，故采用極端頂點設(shè)計法，設(shè)置大曲上限為1（100%），下限為0.5（50%），菌株M8麩曲和菌株M4麩曲的上限為0.4（40%），下限為0.1（10%）。大曲與麩曲的總添加量為原料的40%。利用Minitab 16實現(xiàn)混料回歸設(shè)計，確定菌株M8麩曲（X1）、菌株M4麩曲（X2）和大曲（X3）添加量，試驗結(jié)果如表1所示。其添加量交互作用的響應(yīng)面與等高線見圖5，方差分析見表2。

表1 M8麩曲、M4麩曲、大曲比例優(yōu)化Minitab 16混料回歸試驗設(shè)計與結(jié)果Table 1 Design and results of mixed material regression experiments for Fuqu M8,Fuqu M4 and Daqu ratio optimization by Minitab 16

圖5 菌株M8麩曲、菌株M4麩曲和大曲添加比例對酒精度的影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between Fuqu M8,Fuqu M4 and Daqu ratio on alcohol content

由圖5（a）可知，3種添加物按一定比例接種于酒精發(fā)酵，酒精度比單獨接種菌株M8、M4麩曲和大曲的酒精度高。由圖5（b）可知，菌株M8、M4麩曲和大曲之間的交互作用比較明顯。菌株M8和M4麩曲在較低添加比例時對酒精發(fā)酵的酒精度影響較大。這可能因為大曲中微生物種類較多，添加過量時，由于底物濃度的限制，不利于微生物發(fā)酵[16-18]，或大量的外來物種改變了大曲中微生物種群結(jié)構(gòu)，抑制某些微生物的生長繁殖，不利于發(fā)酵[19-20]；但加入少量菌株M8麩曲或菌株M4麩曲可對發(fā)酵起促進(jìn)作用。酒精度隨著大曲添加量的增加先增大后減??；添加少量的菌株M8麩曲或菌株M4麩曲有利于酒精度的提高。

利用Minitab 16軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，得一次交互回歸方程模型為：酒精度Y=-63.31X1-58.7X2-7.73X3+72.95X1X2+157.19X1X3+153.56X2X3。利用線性規(guī)劃求解上述方程，約束條件為：X1+X2+X3=1.0；0X1≤0.1；0≤X2≤0.1；0≤X3≤0.5。求解得出X1=0.170249，X2=0.202217，X3=0.627 534，即80 g原料中，按40%的比例添加曲，其中大曲25.1%，菌株M8麩曲6.81%，菌株M4麩曲8.09%，安琪酵母0.06%，料水比1∶3，酒精度達(dá)11.2%vol。

表2 回歸模型的方差分析Table 2 Variance analysis of regression model

由表2可知，P＜0.01，表明試驗所選用模型有高度的顯著性，故可用此模型來確定X1、X2和X3的添加比例。從回歸方程模型可得，二次項的系數(shù)均為正數(shù)，表明M8麩曲和M4麩曲、M8麩曲和大曲、M4麩曲和大曲的交互作用較明顯，且二次項回歸系數(shù)絕對值大小為X1X3＞X2X3＞X1X2。說明在酒精發(fā)酵時，M8麩曲和大曲的添加比例對酒精度的影響最大，M4麩曲和大曲的添加比例對酒精度的影響次之，M8麩曲和M4麩曲的添加比例對酒精度影響最小。

2.5.2 強化大曲與大曲發(fā)酵醋質(zhì)量指標(biāo)比較

大曲單獨發(fā)酵以及M4、M8和大曲共酵對發(fā)酵醋指標(biāo)的影響見表3。由表3可知，本試驗沒有添加外源催化劑，從微生物學(xué)角度對傳統(tǒng)釀醋工藝進(jìn)行了改良，將M4、M8麩曲與大曲共發(fā)酵，使新醋中的總酸、不揮發(fā)酸、還原糖、可溶性固形物、氨基酸態(tài)氮、總酯的含量提高，且食醋各項質(zhì)量指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)[4]。

表3 麩曲大曲共酵與大曲發(fā)酵醋質(zhì)量指標(biāo)比較Table 3 Comparison of quality indexes of vinegar by Fuqu+Daqu co-fermentation and Daqu fermentation

2.5.3 M4、M8麩曲與大曲發(fā)酵對大曲用量、酒精度和原料利用率的影響

大曲以及大曲麩曲共酵對發(fā)酵液酒精度和原料利用率的影響見表4。由表4可知，與單獨大曲發(fā)酵相比，原料利用率分別提高了25.28%（M0）、25.70%（M4）、28.83%（M8）、31.81%（M4+M8）。同時，以玉米為原料進(jìn)行發(fā)酵時，大曲+M8麩曲+M4麩曲發(fā)酵后的酒精度＞大曲+M8麩曲＞大曲+M4麩曲＞大曲+M0麩曲＞大曲。此外，大曲+M4+M8麩曲按最適比例發(fā)酵時，每80g原料，大曲用量僅為20.08g，減少了37.25%的用量。

表4 菌株M4、M8麩曲與大曲發(fā)酵對酒精度和原料利用率的影響Table 4 Effect of Fuqu M4,M8 and Daqu fermentation on alcohol content and raw material utilization rate

3 結(jié)論

Minitab 16混料回歸設(shè)計試驗結(jié)果表明，發(fā)酵配料時，大曲與麩曲的總添加量為玉米主料的40%，其中大曲25.1%，M8麩曲6.81%，M4麩曲8.09%，安琪酵母0.06%，料水比1∶3（g∶mL），此時酒精度為11.2%vol，且大曲+M8麩曲+M4麩曲共發(fā)酵可減少大曲用量37.25%?？傊名熐鷣泶娲笄?，提高原料利用率的同時，減少大曲用量，節(jié)約成本，為老陳醋的加工提供了新的加工理念。

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