梨萜類合成酶基因家族生物信息學(xué)與表達模式分析

趙榮榮 劉斌 郭超 劉恒 張元湖

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院 作物生物學(xué)國家重點實驗室，泰安 271018）

萜類化合物（Terpenoids）是指由異戊二烯（Isoprene，C5）為基本結(jié)構(gòu)單元組成的一類天然化合物。萜類作為植物體內(nèi)一類重要的次生代謝產(chǎn)物，由初生代謝途徑衍生而來，具有聚異戊二烯的碳骨架，根據(jù)異戊二烯的數(shù)目可以分為單萜（Monoterpene，C10）、倍半萜（Sesquiterpene，C15）、二萜（Diterpene，C20）、三萜（Triterpene，C30）和多萜。萜類化合物普遍存在于各種植物中，對植物的生長發(fā)育、防御等有重要的作用，同時也是梨和蘋果等花果實芳香物質(zhì)的來源之一。植物中的萜類化合物根據(jù)其生理功能的不同可以分為初生代謝物和次生代謝物。初生代謝物對植物的生長發(fā)育必不可少，包括胡蘿卜素、類胡蘿卜素、甾體、多聚萜醇和植物激素等，次生代謝物的種類繁多，在植物與環(huán)境的相互作用、植物與昆蟲和動物之間的相互作用以及植物體之間的信號傳遞發(fā)揮重要的作用。一些萜類成分具有很高的藥用價值和醫(yī)療價值，如倍半萜成分青蒿素是目前治療瘧疾的最佳藥物［1］，紫杉醇是抗腫瘤的有效藥物等［2］。萜類化合物通過類異戊二烯途徑產(chǎn)生，研究表明，植物中類異戊二烯至少存在2條合成途徑，包括經(jīng)典的甲羥戊酸途徑和丙酮酸/磷酸甘油醛途徑［3-5］。

萜類合成酶作為萜類合成途徑的關(guān)鍵酶是目前比較關(guān)注的研究方向之一，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）［6］、水稻（Oryza sativa）［7］、番茄（Solanum lycopersicum）［8］、楊樹（populus trichocarpa）［9］、大冷杉（Abies grandis）［10］、葡萄（Vitis viniferaL.）［11］和蘋果（Malus domestica）［12］等植物中均有報導(dǎo)。梨基因組測序的完成和序列釋放為梨萜類合成途徑中各種關(guān)鍵酶的研究提供了可能［13］。Bohlmann等［14］在1998年根據(jù)萜類合成酶氨基酸序列的相關(guān)性把來自煙草、蕎麥等多個物種共33條萜類合成酶基因分為6個亞家族；Trapp等［15］在2001年根據(jù)基因結(jié)構(gòu)把被子植物的萜類合成酶基因分為三類。

梨果實的內(nèi)在品質(zhì)主要決定于果實的香氣和風(fēng)味，其中，果實香氣成分主要由其揮發(fā)性的產(chǎn)物組成，而萜類化合物是其揮發(fā)性產(chǎn)物的重要組成部分。在高等植物中，TPS基因均以基因家族的形式存在。梨作為一種重要的經(jīng)濟作物，在基因組水平對其TPS基因家族的研究成果還非常匱乏。本研究通過整合梨CDS、全基因組數(shù)據(jù)和蛋白組數(shù)據(jù)等，結(jié)合生物信息學(xué)和分子生物學(xué)方法，對梨萜類合成酶基因家族進行各種分析，包括梨萜類合成酶基因家族成員的鑒定，理化性質(zhì)和二、三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，保守基序分析和組織表達模式分析等，旨在為梨TPS基因家族成員各基因的具體生物學(xué)功能和改良梨果實品質(zhì)的后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

梨（Pyrus bretschneideri）全基因組數(shù)據(jù)下載于http://gigadb.org/dataset/100083。TPS蛋 白 質(zhì) 序列來源于NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（GenBank），蘋果（Malus domestica）AAO22848.2；擬南芥（Arabidopsis thaliana）AAO85539.1，AAG09310.1，AAO85533.1；大 冷 杉（Abies grandis）AAB70907.1；玉 米（Zea mays）AAA73960.1； 南 瓜（Cucurbita maxima）AAD04292.1，AAB39482.1；金 魚 草（Antirrhinum majus）AAO42614.1；番 茄（Solanum lycopersicum）AAC39431.1；黃瓜（Cucumis sativus）BAB19275.1。供試材料品種為西洋梨，取自于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹實驗基地。取3年生野生西洋梨新生幼葉、幼芽、根和莖，用錫箔紙包好，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 梨TPS基因家族成員的鑒定 從梨（Pyrus bretschneideri）全基因組數(shù)據(jù)庫（http://gigadb.org/dataset/100083）下載基因組和蛋白組數(shù)據(jù)，構(gòu)建本地BLAST數(shù)據(jù)庫［16］，以GenBank中已注冊的50條TPS蛋白序列作為查詢序列執(zhí)行本地BLASTP搜索，搜索的e值設(shè)置為（e-10）。搜索出的萜類合成酶同源序列使用保守域預(yù)測軟件Pfam和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）在線工具檢測候選蛋白質(zhì)序列［17］，使用Pfam數(shù)據(jù)庫的序列號PF01397（萜類合成酶N末端結(jié)構(gòu)域）和PF03936（金屬離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域）鑒定梨TPS基因。

1.2.2 梨TPS基因家族的蛋白理化性質(zhì)和亞細胞定位分析 使用ExPASy在線工具（http://www.expasy.org/proteomics）對鑒定出的所有蛋白序列進行氨基酸數(shù)目、分子量、等電點以及開放閱讀框等的預(yù)測。使用SOPMA（http://www.expasy. org/proteomics）進行TPS蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。通過WOLF PSORT（http://www.genscript.com/ wolf-psort.html）和Targetp1.1共同進行TPS基因的亞細胞定位分析。

1.2.3 梨TPS基因家族系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建 使用Clustal X方法對梨TPS氨基酸序列進行多重序列比對，使用MEGA6.0軟件進行鄰接法系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建，校驗參數(shù)Bootstrap重復(fù)1 000次，對獲得的進化樹進行亞族分類和進化分析［18］。

1.2.4 TPS蛋白保守域和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 使用在線軟件 MEME（http://meme-suite.org/tools/meme） 對TPS蛋白保守域進行分析［19］。根據(jù)已知的梨TPS蛋白完整序列，通過在線工具SWISS-MODEL進行同源建模獲得梨TPS蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型［20，21］。

1.2.5 TPS基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)和染色體定位分析 根據(jù)從梨全基因組數(shù)據(jù)庫下載得到的外顯子、內(nèi)含子和梨基因組定位信息從基因庫中提取待分析的蛋白相關(guān)信息，按GSDS所需格式整理，提交至GSDS在線網(wǎng)站進行基因結(jié)構(gòu)分析。在梨基因組數(shù)據(jù)庫中檢索每一條TPS基因在染色體上的起始位置、終止位置和每一條蛋白在染色體上的位置信息。

1.2.6 梨TPS基因的組織表達分析 使用TIANGEN公司產(chǎn)品RNAprep Pure Plant Kit提取西洋梨根、莖、新生幼葉、幼芽總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastQuant RT Kit（With gDNase） 合 成 cDNA。 設(shè)計實時熒光定量PCR引物（表1）。采用梨ACTIN（AF386514）作為內(nèi)參基因。方法按照CWBIO公司UltraSYBR Mixture（Low ROX）說明書進行。反應(yīng)體系為 2×UltraSYBR Mixture（Low ROX）9 μL、引物 1（10 μmol/L）0.5 μL、引 物 2（10 μmol/L）0.5 μL、cDNA 1 μL 和 ddH2O 9 μL。反應(yīng)條件為 95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)，溶解曲線的溫度是65℃-95℃。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 梨TPS基因家族的鑒定和理化性質(zhì)分析

以GenBank中已經(jīng)注冊的50條TPS基因作為查詢序列初步篩選得到49個候選蛋白序列。使用Pfam和SMART確定保守結(jié)構(gòu)域，刪除不含有典型結(jié)構(gòu)域PF01397（萜類合成酶N末端結(jié)構(gòu)域）、PF03936（金屬離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域）的蛋白序列，最終得到33個TPS基因家族成員，少于擬南芥（40個）和番茄（44個）。參考擬南芥中TPS的命名方式，將梨TPS分別命名為PbrTPS1-PbrTPS33。利用ExPASy提供的在線工具對各條基因的基本信息進行預(yù)測，包括分子量、等電點、基因位置和CDS長度等（表2），結(jié)果表明，梨TPS的CDS長度范圍為645-2 451，ORF長度范圍為1 159-23 665。通過分析發(fā)現(xiàn)，鑒定得到33條梨TPS基因家族成員的等電點均小于7，推測大多數(shù)的梨TPS基因可能編碼弱酸性蛋白，在酸性的亞細胞環(huán)境中發(fā)揮作用。

染色體定位結(jié)果表明，33個TPS基因家族成員分別定位在梨的8條染色體上。分析發(fā)現(xiàn)，定位到第12染色體上的TPS基因序列數(shù)量最多。各有一條分別定位在第8、第10和第17染色體。其中，PbrTPS3、PbrTPS5、PbrTPS6、PbrTPS7、PbrTPS30和PbrTPS31定位在scaffold上（表2）。

2.2 TPS基因家族成員二級結(jié)構(gòu)和亞細胞定位分析

Protscale預(yù)測結(jié)果表明33條TPS基因家族成員均屬于親水性蛋白。使用SOPAM程序（http://www.expasy.org/proteomics）對33條蛋白序列進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果（表3）表明，梨TPS蛋白序列均由α-螺旋、無規(guī)卷曲和延伸鏈等二級結(jié)構(gòu)元件組成。除PbrTPS24、PbrTPS25、PbrTPS27和PbrTPS30以 無規(guī)卷曲為主要二級結(jié)構(gòu)存在外，另外29條蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)主要形式均以α-螺旋形式出現(xiàn)。

使用WOLF PSORT和Targetp1.1工具共同進行亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果（表3）表明，33條TPS蛋白大部分定位于細胞質(zhì)，但是也有少數(shù)分別定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體、細胞核等部位。

2.3 梨TPS基因家族成員系統(tǒng)進化和基因結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 梨TPS蛋白系統(tǒng)進化分析 為了進一步了解梨TPS基因家族成員的系統(tǒng)進化關(guān)系，使用軟件MAGA6.0采用鄰接法對已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的33條梨TPS蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹進行進化聚類和分析，參照Bohlmann等［14］對TPS基因家族的分類方法對梨TPS基因家族進行亞家族分類，發(fā)現(xiàn)33個梨TPS蛋白可以分為5個亞族（圖1）。同時使用這33條序列與NCBI已經(jīng)注冊的擬南芥（Arabidopsis thaliana）、蘋果（Malus domestica）、番茄（Solanum lycopersicum） 等 植 物 中 的 TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-g和TPS-e/f亞家族各成員共同構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)僅有33條序列進行分類的結(jié)果相同（圖2）。因此確認各亞家族含有的TPS基因家族成員的數(shù)量各不相同。其中TPS-a亞家族包含的成員數(shù)量最多，與葡萄［22］和中粒咖啡［23］等植物研究過程中發(fā)現(xiàn)的規(guī)律相似。

表2 梨TPS基因家族成員信息

2.3.2 梨TPS基因家族基因結(jié)構(gòu)分析 使用GSDS網(wǎng)站對基因結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。結(jié)果（圖3）表明，基因結(jié)構(gòu)特征和亞家族之間具有對應(yīng)關(guān)系，同一亞家族成員基因結(jié)構(gòu)之間非常相似，內(nèi)含子數(shù)量3-15個，但多數(shù)含有4-7個。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，TPS-a亞族的外顯子數(shù)量均比較多而且密集，除Pbr024828.1之外，TPS-a亞族和TPS-b亞族包含4-7個外顯子，而TPS-c亞族和TPS-g亞族的內(nèi)含子外顯子組成則比較分散，但是各亞族內(nèi)的組成結(jié)構(gòu)都比較相似，因此，推測各組內(nèi)的基因家族成員間在進化關(guān)系上也較近。

表3 梨TPS蛋白家族二級結(jié)構(gòu)和亞細胞定位

2.4 梨TPS基因家族成員的保守基序分析

圖1 梨TPS基因家族系統(tǒng)進化樹

為了進一步分析梨TPS蛋白序列在各個亞族上的差異，使用MEME在線軟件對TPS基因家族的保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，最終獲得20個保守基序（圖4）。分析發(fā)現(xiàn)，TPS-a亞族蛋白大多含有較多的基序數(shù)目，在TPS-a亞族中多數(shù)第一個保守序列是Motif12，其對應(yīng)的序列為DTFDVHRPKPSATFSP SIWGDHFJSYASLZVDAELEQHVQE，而以Motif20為結(jié)束的保守基序?qū)?yīng)的序列是KDLIASTLVEPVPL。另外，TPS-a中保守基序個數(shù)相對較多，而TPS-e/f的Motif個數(shù)相對較少。除PbrTPS5外，其余TPS基因家族成員中均含有Motif1和Motif3這兩個保守基序，因此，這2個位點所包含的序列DLYDLYTVALRFRLLRQHGYNVS和YYFWSLGVY FEPQYSFARKILTKVTAJVTIIDDIYD在梨TPS蛋白中是高度保守的。Motif1、Motif7、Motif12構(gòu)成了靠近N端的TPS保守結(jié)構(gòu)域序列，Motif2、Motif10、Motif20構(gòu)成了靠近C端的保守基序。

圖2 梨與其他植物TPS蛋白的系統(tǒng)進化樹

對發(fā)現(xiàn)的20個保守基序進行Pfam和SMART注釋分析后共對4個基序進行了命名，分別是基序2、基序3、基序6和基序7（圖5），SMART驗證結(jié)果顯示基序7是萜類合成酶N末端結(jié)構(gòu)域PF01397所包含的基序，基序2、3、6是金屬離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域PF03936所包含的基序，剩余的Motif保守基序是未知的功能元件。

2.5 梨TPS基因家族成員的三級結(jié)構(gòu)分析

圖3 梨TPS基因家族基因結(jié)構(gòu)分析

圖4 梨TPS基因家族保守基序分析

圖5 梨TPS氨基酸序列Logo圖譜

蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能很大程度上取決于蛋白的空間結(jié)構(gòu)，因此蛋白結(jié)構(gòu)分析對于其功能的研究具有重要意義。使用在線工具SWISS-MODEL對梨TPS蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行同源建模。在對33個梨TPS蛋白進行同源建模后，發(fā)現(xiàn)TPS-a、TPS-c、TPS-g和TPS-e/f亞家族內(nèi)的蛋白質(zhì)在空間結(jié)構(gòu)上都高度相似，各亞族內(nèi)蛋白質(zhì)具有高度保守的結(jié)構(gòu)特征，因此分別在上述4個TPS亞家族中各選擇2個作為代表性的序列進行同源建模（圖6），對TPS-b亞家族所有成員進行三級結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)得到的三維結(jié)構(gòu)具有差異（圖6），推測TPS-a、TPS-c、TPS-g和TPS-e/f亞家族內(nèi)蛋白質(zhì)具有相似的功能而TPS-b亞家族成員在發(fā)揮的功能上可能有所差異。

圖6 梨TPS蛋白三級結(jié)構(gòu)

2.6 梨TPS基因表達分析

基于梨TPS基因的序列相似性和三級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，對上述已經(jīng)進行三級結(jié)構(gòu)分析的10條序列進行組織表達模式分析。結(jié)果（圖7-A）顯示，除PbrTPS24外，其余9個PbrTPS在根、莖、幼葉和幼芽中均有表達，且呈現(xiàn)出多種相對表達模式。另外，PbrTPS11、PbrTPS15、PbrTPS27、PbrTPS30和PbrTPS31在莖中的表達量最高，PbrTPS26、PbrTPS28和PbrTPS29在根中的表達量最高，PbrTPS23和PbrTPS24在葉中高表達（圖7-B）。

圖7 PbrTPS在梨不同組織中的表達分析

3 討論

萜類合成酶是萜類化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶。近年來，不同物種基因組測序相繼完成，使得從基因組的角度分析和研究基因家族成為可能［22-24］。目前，多個物種中的TPS基因家族成員已經(jīng)被鑒定出來，在模式植物擬南芥［6］中發(fā)現(xiàn)了40個TPS基因家族成員，在番茄［8］中發(fā)現(xiàn)了44個TPS基因家族成員。在對擬南芥全基因組分析得到的40個TPS分析后發(fā)現(xiàn)，其中30個基因在序列相關(guān)性、基因結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育上非常相似，推測可能是由于在其進化過程中序列上發(fā)生了改變，出現(xiàn)了基因的片段重復(fù)或者串聯(lián)重復(fù)等，進而導(dǎo)致不同酶結(jié)構(gòu)和功能的不同［6］。本研究對梨與其它植物TPS蛋白的系統(tǒng)進化樹研究，同樣發(fā)現(xiàn)大多數(shù)處于同一個亞族的TPS基因不僅在進化上關(guān)系較近，同源建模結(jié)果顯示蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)也非常相似，推測其編碼的蛋白質(zhì)功能也非常相似。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，梨TPS蛋白二級結(jié)構(gòu)序列均由α-螺旋、無規(guī)卷曲和延伸鏈等形式組成，α-螺旋和無規(guī)卷曲是其主要組成元件，這與在蘋果［12］等植物中不同二級結(jié)構(gòu)元件的比例和分布規(guī)律相似，推測不同來源的植物中TPS基因可能發(fā)揮相似的功能。Yoshikuni等［25］研究表明，功能專一性的酶是由功能復(fù)雜的酶進化而來，少量氨基酸之間的替換可以促進酶功能上的進化，因此，在同一個物種中通過基因進化出現(xiàn)多種不同萜類合成酶很有可能促進萜類代謝下游產(chǎn)物種類的增多。研究表明，TPS基因家族不僅廣泛的存在于各種植物中，在不同植物基因組中其基因家族成員的數(shù)目差異也較大。對多種已經(jīng)完成測序的植物中的TPS基因家族成員進行分類分析后發(fā)現(xiàn)，除大豆外，其他雙子葉植物和單子葉植物的TPS基因家族中TPS-a亞家族成員數(shù)目最多［26，27］，在本實驗中發(fā)現(xiàn)共有20個TPS基因?qū)儆赥PS-a亞家族，占梨中TPS基因的大多數(shù)，因此推測在梨中，倍半萜類化合物種類和數(shù)量最為豐富，而在本研究中并沒有發(fā)現(xiàn)TPS-d基因家族的成員，研究表明TPS-d基因家族是裸子植物特有的相對獨立的基因家族分支［23］，而梨樹屬于被子植物，這可能是在梨基因組中沒有鑒定到TPS-d亞家族成員的主要原因。

目前，TPS基因家族的研究主要集中于蘋果、擬南芥和番茄等植物中，而關(guān)于梨TPS基因家族的研究尚未見到報導(dǎo)。本研究根據(jù)梨與擬南芥中TPS基因的同源性進行了命名，所獲得的TPS基因數(shù)目低于蘋果中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TPS基因數(shù)目，推測可能是由于梨的全基因組學(xué)研究的不完全性導(dǎo)致，但仍有可能在梨中其自身的TPS基因家族成員數(shù)目相對較少。使用MEME在線工具進行保守基序預(yù)測，最終對4個基序進行命名。另外，梨TPS基因在染色體上呈隨機不均勻分布，這也與TPS基因在其他物種染色體上的分布規(guī)律相似，如蒺藜苜蓿的23條TPS基因在第1、4、8染色體上均沒有分布［28］。目前研究結(jié)果表明能夠正常發(fā)揮功能的萜類合成酶基因長度一般最少在300 bp以上，如紅豆杉中的紫杉二烯合成酶基因編碼303個氨基酸［29］，而在本研究發(fā)現(xiàn)PbrTPS10僅由214個氨基酸編碼，推測可能是由于基因組進化過程中發(fā)生了片段缺失現(xiàn)象，但是其是否能夠發(fā)揮萜類合成酶的正常功能，還需要后續(xù)的實驗進一步驗證。在對不同基因家族成員的組織表達模式進行分析發(fā)現(xiàn)，萜類合成酶基因的表達存在組織特異性，例如PbrTPS30在莖中的表達量比幼葉和幼芽中高9倍左右，PbrTPS24在根中基本不表達，這可能是由于萜類化合物存在物種和組織特異性，因此萜類合成酶基因的表達也存在組織特異性。

萜類合成酶是合成萜類代謝終產(chǎn)物的關(guān)鍵酶，是萜類化合物合成過程中的直接催化者，因此萜類合成酶催化的反應(yīng)步驟是植物萜類代謝途徑中的靶位點。由于植物體內(nèi)大部分與萜類合成相關(guān)的酶表達量較低，相應(yīng)的萜類化合物產(chǎn)量較低很難提取和純化，因此需要在深入的了解萜類代謝途徑的同時，更多的鑒定和分離出萜類合成過程中的各種關(guān)鍵酶，進而通過基因工程技術(shù)提高目的萜類化合物的生物合成水平。梨樹是重要的經(jīng)濟作物，同時也具有重要的生態(tài)價值和觀賞價值。梨果實中的芳香物質(zhì)是評價果實內(nèi)在品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。近年來研究表明，果實中的揮發(fā)性物質(zhì)主要包括醇類、醛類和脂類等，目前對西洋梨的研究大多集中于果實采摘后生理特性和貯藏技術(shù)的研究，而對其香氣成分的研究相對較少。萜類合成酶與果實中各種揮發(fā)性萜類物質(zhì)的種類和含量密切相關(guān)，因此，研究梨TPS基因家族各成員對提高果實品質(zhì)也具有重要意義。

4 結(jié)論

基于梨基因組數(shù)據(jù)庫共鑒定獲得33個梨萜類合成酶基因，定位于梨的8條染色體上，聚類為5個亞家族，其中，TPS-a亞家族成員數(shù)量最多，包括20個TPS基因，并且未發(fā)現(xiàn)TPS-d基因家族成員，各亞家族TPS蛋白三級結(jié)構(gòu)高度相似。TPS基因家族成員存在組織特異性表達。

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