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    極端嗜酸熱古菌Acidianus manzaensis硫氧化模型構(gòu)建

    2018-06-07 02:30:52朱薇馬亞龍
    生物技術(shù)通報(bào) 2018年5期
    關(guān)鍵詞:嗜酸底物基因組

    朱薇 馬亞龍

    (1. 湖南工業(yè)大學(xué),株洲 412000;2. 中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院,長(zhǎng)沙 410083)

    單質(zhì)硫(S0)的微生物氧化是硫的生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程中最重要的反應(yīng)之一,這些微生物一方面通過(guò)對(duì)S0的氧化為其自身生長(zhǎng)提供能量[1];另一方面通過(guò)溶解自然界中的含硫礦物,釋放一些金屬離子。因此,人們利用微生物對(duì)S0的氧化作用掀起了一門(mén)新興技術(shù)——生物濕法冶金技術(shù)(Biohydrometallurgy),即利用微生物法提取復(fù)雜低品位原生硫化礦(包括含銅、鈾、金、鈷和鉛等硫化礦)中的有價(jià)金屬及對(duì)金礦表面的硫化礦進(jìn)行氧化預(yù)處理[2-3]。

    硫化礦生物浸出的微生物根據(jù)其最適生長(zhǎng)溫度可劃分為常溫微生物(30-40℃)、中度嗜熱微生物(40-60℃)和極端嗜熱微生物(60-80℃)[4]。與常見(jiàn)的中溫菌相比,極端嗜酸熱古菌由于具有耐高溫、提取速率快和浸出率高等特點(diǎn),在生物冶金工業(yè)應(yīng)用上有著很大的潛力,正逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)。其中硫氧化機(jī)制及其代謝途徑是所有研究的核心,但是目前對(duì)于極端嗜酸熱古菌的硫氧化相關(guān)酶基因的注解非常缺乏,人們對(duì)嗜酸熱古菌硫氧化過(guò)程缺乏清晰的認(rèn)識(shí)和了解[5-6]。萬(wàn)座嗜酸兩面菌Acidianus manzaensis是嗜酸菌屬的一個(gè)新種,是一株最適生長(zhǎng)溫度在70℃左右的極端嗜酸熱古菌,屬于兼性厭氧和兼性化能自養(yǎng)微生物,能夠在S0和亞鐵(Fe2+)中進(jìn)行生長(zhǎng),在生物浸出過(guò)程中顯示出了很強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值[7-9]。

    A.manzaensisYN-25菌全基因組測(cè)序的完成為深入了解極端嗜酸熱古菌硫氧化機(jī)理和代謝途徑提供了大量信息[10]。本研究基于典型的極端嗜酸熱古菌A. manzaensisYN-25已公布的全基因組序列信息,通過(guò)生物信息學(xué)分析和基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄技術(shù)驗(yàn)證了與硫氧化相關(guān)功能基因,并通過(guò)對(duì)前述結(jié)果的分析,擬構(gòu)建極端嗜酸熱古菌A. manzaensis菌的硫氧化模型,旨在了解嗜酸熱古菌在硫氧化機(jī)制方面與硫氧化細(xì)菌的區(qū)別和聯(lián)系,并為以后闡明嗜酸熱古菌硫氧化機(jī)制的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    MgSO4·7H2O,K2HPO4,(NH4)2SO4,KCl,Ca(NO3)2均購(gòu)自上海生工;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和總RNA提取試劑盒均購(gòu)自于天根生化科技有限公司;引物由湖南擎科生物技術(shù)有限公司(TSINGKE Biological Technology)合成;ReverTra Ace-α-第一鏈cDNA合成試劑盒,HUNDERBIRDTM SYBR? qPCR Mix均購(gòu)自于日本東洋紡公司(Toyobo co.,LTD.,Osaka,Japan);RT-qPCR 在 iCycler iQTM Real-time PCR 儀(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,USA)上完成。

    1.2 方法

    1.2.1 菌株及培養(yǎng)基 本實(shí)驗(yàn)所用菌株Acidianus manzaensisYN-25由中南大學(xué)生物冶金重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供,培養(yǎng)基配方:0.5 g/L MgSO4·7H2O;0.5 g/L K2HPO4;3.0 g/L(NH4)2SO4;0.1 g/L KCl;0.01 g/L Ca(NO3)2,添加 0.02%(W/V)酵母提取物作為生長(zhǎng)因子,并分別加入10 g/L的S0、20 g/L的FeSO4·7H2O作為能源底物,培養(yǎng)基初始pH用濃硫酸分別調(diào)到 2.0(S0能源底物)和 1.5(Fe2+為能源底物)。在 500 mL的三角瓶中培養(yǎng)A. manzaensis,接種前將裝有200 mL培養(yǎng)基的三角瓶在滅菌鍋中 121℃滅菌20 min,待培養(yǎng)基冷卻后進(jìn)行接種,初始接種菌濃均為 107個(gè)/mL,在 65℃、170 r/min的空氣浴搖床中培養(yǎng)。

    1.2.2 S0和Fe2+能源底物中的A. manzaensis菌生長(zhǎng)特性A. manzaensis在不同能源底物S0和Fe2+的培養(yǎng)過(guò)程中,每隔12 h取液體樣品分別測(cè)定細(xì)胞密度、pH值、SO42-和Fe3+。其中細(xì)胞密度采用光學(xué)顯微鏡直接鏡檢計(jì)數(shù)法,pH值使用pH計(jì)測(cè)定(雷磁PHS-3C),SO42-用改良的硫酸鋇比濁法測(cè)定[11](在 50 mL比色管中分別加入 6.0 mL BaCl2標(biāo)準(zhǔn)溶液、6.0 mL無(wú)水乙醇、2.0 mL 0.1 g/L Tween-80和 5 mL Na2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液,最后用pH 1.0鹽酸溶液定容至 50 mL,定容之后靜置 5 min在波長(zhǎng)為 420 nm可見(jiàn)光范圍內(nèi)測(cè)量吸光值)。Fe3+采用磺基水楊酸法測(cè)定[12](在50 mL比色管中分別加入 3 mL待測(cè)樣品溶液、20%磺基水楊酸 10 mL,定容至 50 mL,靜置 5 min后在波長(zhǎng)為 420 nm可見(jiàn)光范圍內(nèi)測(cè)量吸光值)。

    1.2.3 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索硫氧化基因及引物設(shè)計(jì)A.manzaensisYN-25的全基因組序列和完整的注釋通過(guò)檢索NCBI(登錄號(hào)為CP020447)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得,根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到的相關(guān)基因信息采用Primer3(v.0.4.0)在線引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)引物(表 1),相應(yīng)蛋白質(zhì)序列通過(guò)檢索NCBI Nonredundant Database數(shù)據(jù)庫(kù)獲得[13],蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位通過(guò)開(kāi)放閱讀課框中可能的跨膜區(qū)域由TMHMM 2.0 服務(wù)器(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)和THUMBUP服務(wù)器(http://sparks.informatics.iupui.edu/Softwares-Services_files/thumbup.htm)在線分析[14-15]。

    1.2.4 RT-qPCR驗(yàn)證篩選S0氧化相關(guān)基因 為了驗(yàn)證篩選的20個(gè)基因與S0氧化相關(guān)性,采用RT-qPCR對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)。用于RT-qPCR的細(xì)胞收集于對(duì)數(shù)中期,總RNA的提取和總基因組DNA的提取分別采用細(xì)菌總RNA提取試劑盒和細(xì)菌總基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)。對(duì)提取的總RNA用微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific NanoDrop? ND-1000 spectrophotometer) 測(cè)定其濃度,同時(shí)采用A260/A280和A260/A230的比值對(duì)所提RNA的純度和質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。以提取的總RNA用作模板,采用ReverTra Ace-α-第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),合成相應(yīng)的cDNA。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)以cDNA為模板,使用高效率SYBR熒光定 量 PCR mix QPK-201(Toyobo co.,LTD.,Osaka,Japan)配制反應(yīng)體系后在iCycler iQTM Real-time PCR 儀(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,USA)上進(jìn)行,每個(gè)反應(yīng)設(shè) 3 個(gè)重復(fù)。

    表1 用于RT-qPCR引物序列信息

    RT-qPCR分以下幾個(gè)程序:(1)98℃預(yù)變性 2 min ;(2)98℃解鏈 10 s,56℃復(fù)性 30 s,68℃延伸30 s,共設(shè) 40 個(gè)循環(huán),并在每個(gè)循環(huán)的退火階段檢測(cè)熒光信號(hào);(3)循環(huán)結(jié)束后反應(yīng)溫度從 55℃開(kāi)始梯度升高到 98℃作產(chǎn)物的熔解曲線,升溫時(shí)每次增加 0.5℃。對(duì)RT-qPCR采集的數(shù)據(jù),用16S rDNA基因作為內(nèi)部參照校正,用(1+E)-ΔΔCq法進(jìn)行計(jì)算(其中E為擴(kuò)增效率,Cq值為熒光信號(hào)達(dá)到域值時(shí)的循環(huán)數(shù)),分析各個(gè)基因在不同能源底物培養(yǎng)時(shí)的相對(duì)表達(dá)量[16]。結(jié)果用log2[S0/Fe2+]±SD表示,并采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析,即log2[S0/Fe2+]≥0.7(P≤ 0.05)表示為在S0能源底物下表達(dá)上調(diào),如果log2[S0/Fe2+]≤ - 0.7(P≥0.05)則表示在S0能源底物下表達(dá)下調(diào),即在Fe2+能源底物下表達(dá)上調(diào)。

    2 結(jié)果

    2.1 A. manzaensis菌在S0和Fe2+中的生長(zhǎng)特性

    首先比較研究了A. manzaensis菌在S0和Fe2+兩種不同能源底物下的生長(zhǎng)特性,從圖1可知,在S0為能源底物時(shí)細(xì)胞的延滯期比以Fe2+為能源底物時(shí)長(zhǎng),以可溶性的能源底物FeSO4·7H2O培養(yǎng)的細(xì)胞更容易獲得能量進(jìn)行生長(zhǎng),而作為固體形式的能源底物S0,由于細(xì)胞需要將S0轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)才能進(jìn)一步被氧化利用,但是在S0中生長(zhǎng)的細(xì)胞的對(duì)數(shù)期的細(xì)胞濃度比在Fe2+中高。

    從圖1-A可知,隨著培養(yǎng)時(shí)間的進(jìn)行,溶液中的SO42-逐漸增大,同時(shí)溶液中的pH值也逐漸下降,說(shuō)明A. manzaensis菌逐漸將S0氧化成SO42-,并且生成H+,從而導(dǎo)致溶液pH的下降。

    從圖1-B可以看出,在以Fe2+為能源底物培養(yǎng)過(guò)程中溶液中的Fe3+先增大后減小,而且在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)A. manzaensis菌在Fe2+中生長(zhǎng)時(shí)會(huì)有黃鉀鐵礬(MFe3(SO4)2(OH)6,M 為金屬離子)生成(公式1),伴隨著MFe3(SO4)2(OH)6的生成還有H+的產(chǎn)生,從而導(dǎo)致溶液體系pH值的下降,而且形成黃鉀鐵礬過(guò)程中會(huì)消耗大量的Fe3+,導(dǎo)致溶液中的Fe3+逐漸降低。

    圖1 A. manzaensis菌在S0(A)和Fe2+(B)中的生長(zhǎng)特性

    2.2 A. manzaensis S0氧化相關(guān)基因的篩選及RT-qPCR的驗(yàn)證

    通過(guò)檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中A. manzaensisYN-25的全基因組序列信息,并通過(guò)與其他已經(jīng)公布基因組的嗜熱古菌的基因進(jìn)行BLAST比對(duì),共找到20個(gè)可能與S0氧化基因(表 2),其中包括編碼古菌對(duì)S0氧化的初始反應(yīng)步驟所需的硫氧化還原酶(Sulfur oxygenase-reductase)的sor基因,以及編碼其他的含硫代謝中間產(chǎn)物氧化酶的基因,例如編碼硫代硫酸鹽-醌氧還酶(Thiosulfate-quinone oxidoreductase)的tqo基因,編碼連四硫酸鹽水解酶(Tetrathionate hydrolase)的tetH基因等;同時(shí)還包括編碼電子傳遞體(Cytochrome B6)和末端氧化酶(aa3-type terminal oxidase、NADH :ubiquinone oxidoreductase)的基因;值得注意的是在A. manzaensisYN-25的全基因組注釋信息中包含多個(gè)編碼硫還原蛋白家族(Sulfur reduction protein)的dsrE基因。對(duì)檢索的S0氧化基因的分類(lèi)信息見(jiàn)圖 2。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中A. manzaensisYN-25的注釋信息中沒(méi)有編碼硫化物:醌氧化還原酶(Sulfide:quinone oxidoreductase(SQR))的基因sqr的注釋信息,進(jìn)一步通過(guò)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)在A. manzaensis全基因組中登錄號(hào)為B6F84_03775(注釋信息為pyridine nucleotidedisulfide oxidoreductase)的基因與已有文獻(xiàn)報(bào)道的與A. manzaensis同一個(gè)Acidianus屬的不同種的A.hospitalisW1中的sqr同源性非常高,因此推測(cè)該基因在A. manzaensis菌中起到編碼SQR的功能。

    為了驗(yàn)證篩選的20個(gè)基因與S0氧化相關(guān)性,采用RT-qPCR對(duì)A. manzaensis菌在S0和Fe2+兩種不同能源底物下的基因表達(dá)差異進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)。RT-qPCR結(jié)果(表 3)表明,通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到的20個(gè)A. manzaensis基因中有15個(gè)基因在S0能源底物下均表達(dá)上調(diào),這些上調(diào)的基因中包括編碼對(duì)S0和含硫化合物進(jìn)行氧化的各種酶、電子傳遞體、末端氧化酶、硫還原蛋白家族和硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶的基因,說(shuō)明這些基因與S0的氧化密切相關(guān)。有4個(gè)基因在兩種能源底物下表達(dá)差異并不明顯,值得注意的是soxl基因在S0能源底物下表達(dá)下調(diào)(即在Fe2+為能源底物時(shí)表達(dá)上調(diào)),推測(cè)該基因可能與Fe2+氧化相關(guān)。

    表2 根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到的A. manzaensis S0氧化相關(guān)基因信息

    2.3 A. manzaensis的硫氧化模型構(gòu)建

    根據(jù)對(duì)A. manzaensis菌全基因組注釋信息的分析和RT-qPCR對(duì)所篩選的基因驗(yàn)證結(jié)果,構(gòu)建了極端嗜酸熱古菌A. manzaensis的硫氧化模型(圖 3),即胞外的S0跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)(未知硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后,經(jīng)SOR氧化還原生成S2O32-,SO32-和 H2S,該步反應(yīng)是胞內(nèi)對(duì)S0進(jìn)行氧化的重要步驟,但是該反應(yīng)不能與電子傳遞進(jìn)行偶聯(lián)產(chǎn)生能量,極端嗜酸熱古菌A. manzaensis主要通過(guò)對(duì)SOR反應(yīng)形成的中間產(chǎn)物S2O32-,SO32-和H2S的進(jìn)一步氧化產(chǎn)能,對(duì)這些中間產(chǎn)物氧化得到的電子會(huì)被傳遞給細(xì)胞膜上的氧化性醌(Q2+),使其形成還原性的醌(QH2),QH2最終被末端氧化酶氧化形成NADH和ATP,從而為細(xì)胞生長(zhǎng)提供能量。而S0氧化后形成的終產(chǎn)物SO42-則通過(guò)硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶(Sulfate ABC transporter permease)排到胞外。

    圖2 A. manzaensis菌S0氧化基因功能分類(lèi)及所占比例

    表3 基因RT-qPCR結(jié)果

    3 討論

    極端嗜酸熱古菌的硫氧化在硫的生物地球化學(xué)循環(huán)和硫化礦的生物浸出中起著重要的作用,但是關(guān)于極端嗜酸熱古菌的硫氧化機(jī)理研究較少,主要是因?yàn)槠渥钸m生長(zhǎng)條件大都是在極端的生理生化條件下(高溫、低pH),這給研究其相關(guān)的生化反應(yīng)帶來(lái)了很大的困難。目前,隨著越來(lái)越多的極端嗜酸熱古菌的全基因組測(cè)序的完成,使得利用基因組信息分析相關(guān)代謝機(jī)理的模型成為可能。本文利用已公布的極端嗜酸熱古菌A. manzaensisYN-25的全基因組信息,通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)初步篩選了20個(gè)可能與硫氧化相關(guān)的基因,并進(jìn)一步通過(guò)RT-qPCR對(duì)篩選得到的基因從轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了驗(yàn)證,共鑒定出了15個(gè)與硫氧化相關(guān)的基因,其中包含一系列編碼氧化S0及含硫中間產(chǎn)物的酶[19-20,23-24],它們對(duì)應(yīng)的編碼基因及蛋白酶在細(xì)胞中的定位及所涉及的反應(yīng)等酶的相關(guān)特性見(jiàn)表4。

    圖 3 極端嗜酸熱古菌A. manzaensis的硫氧化模型

    SOR在古菌的硫氧化過(guò)程中起著重要的作用,但是該酶只存在細(xì)胞質(zhì)中,因此胞外的S0需要先經(jīng)過(guò)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中才能被SOR進(jìn)行氧化還原反應(yīng)生成能被進(jìn)一步氧化的中間產(chǎn)物,但是對(duì)于古菌而言,該跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白至今未被找到。Rohwerder和Sand[21]根據(jù)對(duì)嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的Acidithiobacillus ferrooxidans的研究提出S0可能被外膜富含巰基(P-SH)的外膜蛋白鍵和形成類(lèi)似的Pr-SnH(n≥2)結(jié)構(gòu)化合物進(jìn)而被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞周質(zhì)空間被氧化(公式 2),其進(jìn)一步基于同步輻射的原位顯微表征(synchrotron radiation based STXM、μ-XRF))發(fā)現(xiàn),極端嗜酸熱古菌A. manzaensis在以S0為能源底物培養(yǎng)下的細(xì)胞表面的巰基(-SH)是在以Fe2+為能源底物培養(yǎng)下的2.14倍[22],這表明對(duì)于極端嗜酸熱古菌而言,胞外的S0可能同樣被膜上富含-SH的蛋白鍵和形成Pr-SnH(n≥2)結(jié)構(gòu)的復(fù)化合物進(jìn)入細(xì)胞中,該復(fù)合物在胞內(nèi)重新生成S0從而被SOR進(jìn)行氧化還原反應(yīng)生(圖 3)。值得注意的是,在A.manzaensis菌中含有多個(gè)編碼硫還原蛋白家族DsrE的基因,而且其在S0底物下的轉(zhuǎn)錄水平均高于在Fe2+為能源底物下,這說(shuō)明該硫還原蛋白家族DsrE也參與了A. manzaensis的S0氧化過(guò)程。根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道,DsrE蛋白在A. ferrooxidans菌中能夠氧化硫烷硫(Sulfane sulfur,GSSH)(表 4)[23],因此推測(cè)該蛋白家族在古菌中也起到相同的功能。此外,對(duì)A. manzaensis菌的全基因組的分析發(fā)現(xiàn)沒(méi)有編碼腺苷核苷還原酶(Adenosine phosphosulphate reductase,APS)和腺苷酰硫酸磷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(adenylylsulphate phosphate adenyltransferase,APAT)的基因,說(shuō)明對(duì)于A. manzaensis而言,其硫氧化代謝途徑與已報(bào)道的其他嗜酸熱古菌Sulfolobus acidocaldarius和S.solfataricus等相比存在一定的差異[20,24-25]。

    4 結(jié)論

    本研究比較了極端嗜酸熱古菌A.manzaensis在S0和Fe2+兩種不同能源底物培養(yǎng)下的生長(zhǎng)特性,結(jié)果表明細(xì)胞在不同的能源底物下可能通過(guò)不同的硫代謝途徑。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)比較了以單質(zhì)硫(S0)和亞鐵(Fe2+)兩種不同能源底物培養(yǎng)下的基因表達(dá)差異,共鑒定出了15個(gè)與硫氧化相關(guān)的基因,包括一系列編碼能氧化單質(zhì)硫(S0)及含硫中間產(chǎn)物酶、電子傳遞體、末端氧化酶、硫還原蛋白家族和硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶的基因;同時(shí),實(shí)時(shí)定量PCR還發(fā)現(xiàn),A. manzaensis菌中含有多個(gè)dsre基因,這些dsre基因與硫的氧化密切相關(guān)?;谏鲜龇治觯狙芯繕?gòu)建了極端嗜酸熱古菌A.manzaensis的硫氧化模型,該模型與已報(bào)道的其他嗜酸熱古菌如Sulfolobus acidocaldarius和S. solfataricus等相比存在一定的差異。

    表 4 極端嗜酸熱古菌A. manzaensis中S0及含硫化合物氧化相關(guān)酶的特性

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