不同部位苦蕎粉中3種黃酮類成分含量的比較

盧 揚， 劉永翔， 李 俊， 王 輝， 陳朝軍， 陳中愛， 唐健波， 劉 輝

(貴州省農業(yè)科學院生物技術研究所，貴州貴陽 550006)

苦蕎是一種蓼科蕎麥屬植物，因其有高含量的淀粉(71.6%～72.61%)以及抗氧化物質黃酮，兼具藥食兩用的效果?？嗍w的栽培主要集中在我國西南地區(qū)，包括四川、云南、貴州等省(區(qū))，四川省的涼山州被認為是苦蕎種植的發(fā)源之地，是當前世界上苦蕎麥分布最集中、種植面積最大的產區(qū)[1]。貴州省威寧縣地處貴州西北部，高海拔、苦寒環(huán)境適合苦蕎的種植，播種面積達5.33萬hm2以上，是貴州省重要的苦蕎生產基地，也是國內苦蕎生產極其重要的原料供應基地[2]。

由于苦蕎豐富的氨基酸成分，以及具有降血壓、降血脂、抗氧化作用的黃酮類物質[3-4]，已經被開發(fā)成形式多樣的產品，包括苦蕎茶、苦蕎面條、苦蕎沙琪瑪等。貴州省威寧縣的苦蕎加工可追溯到600多年前，威寧縣生產的蕎酥成為明朝開國皇帝朱元璋的御用貢品。經過多年的發(fā)展和工藝改進，目前貴州省威寧縣的苦蕎加工產品有蕎酥、苦蕎米、苦蕎酒、苦蕎飯等。而經過特殊工藝精制而成的苦蕎粉，是面條、饅頭、餃子、糕點等食品的添加原料，且由于工藝不復雜、營養(yǎng)成分損失少等特點，非常適合“三高”人士作為主食食用。2014年，農業(yè)部發(fā)布了NYT 894—2014《綠色食品 蕎麥及蕎麥粉》行業(yè)標準，對苦蕎粉中的總黃酮、水分、黃曲霉毒素、重金屬等提出了不同限度要求，其中總黃酮含量采用分光光度法以蕓香苷含量為標準進行測定。但是，單一成分的測定不能真實反映苦蕎粉中總黃酮含量的實際水平，達不到綜合評價的效果。本研究采用高效液相色譜法，同時測定3個不同部位的苦蕎粉(籽粒粉、芽苗菜粉、蕎麥葉粉)中3種主要黃酮類活性成分蕓香苷、槲皮素和山奈酚含量，并對其進行比較研究，以期為苦蕎粉的應用和質量控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

MS105DU電子天平，購自上海閔勝科技有限公司；LC-20A高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器為SPD-M 20A，自動進樣器為SIL-20A，高壓輸液泵為LC-20A，購自日本島津公司。色譜柱為Agilent ZORBAX Extend-C18(5 μm，250 mm，4.6 mm)，購自美國Thermo公司；電熱恒溫水浴鍋(HWS-26)，購自上海一恒科學儀器有限公司；LGJ-10B真空冷凍干燥機，購自杭州創(chuàng)意真空冷凍干燥設備廠；CS-700超微粉碎機，購自廣州市旭朗機械設備有限公司；UV-2450紫外可見分光光度計，購自日本島津公司。

蕓香苷、槲皮素、山奈酚標準品，均購自中國醫(yī)藥集團化學試劑有限公司。甲醇、乙酸為色譜純，購自貴州金摩爾化學有限公司。黔苦1號苦蕎種子、苦蕎芽苗菜由貴州省生物技術研究所提供，苦蕎葉片采自貴州省威寧縣試驗地。

1.2 試驗方法

本試驗于2016年8—12月在貴州省農業(yè)科學院生物技術研究所農業(yè)生物技術重點實驗室及貴州省威寧縣農業(yè)科學院試驗地完成?？嗍w品種為黔苦6號。

1.2.1 不同來源苦蕎粉的獲得 籽粒粉：參照濮生財等的方法[5]制得。芽苗菜粉的制作：選擇籽粒飽滿的蕎麥種子放在平皿中，加入適量清水浸泡10 h后，將種子轉移至另一個干燥平皿中放置16 h左右。然后將種子均勻地碼在鋪有紗布的帶孔塑料盆中，將紗布蓋上，每天撒適量清水于紗布上，使其保持濕潤。約7 d后，種子經過發(fā)芽、生根、長葉，將上層紗布打開，維持10 h左右，使葉片可以獲得足夠光照，保證芽苗菜有充足的水分。在第13天左右，收集苦蕎芽苗菜500 g，于-30 ℃冰箱預冷凍12 h，然后在真空冷凍干燥器中將芽苗菜凍干，并用超微粉碎機將其打成粉末，即得芽苗菜苦蕎粉。蕎麥葉粉的制作：蕎麥葉片采自貴州省威寧縣試驗地，制粉過程與芽苗菜粉制作過程一致。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX Extend-C185 μm，4.6 mm×250 mm，流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，進樣量為20 μL，檢查波長為365 nm，流動相A：甲醇，流動相B：0.1% 乙酸，進樣量為20 μL，根據表1進行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序

1.2.3 溶液樣品的制備 標準使用液的制備：分別精確稱取10 mg對照品蕓香苷、10 mg槲皮素、10 mg山奈酚于25 mL量瓶中，用甲醇定容，配成濃度分別為400 μg/mL的對照品貯備液。

分別量取5 mL蕓香苷、3 mL槲皮素、2 mL山奈酚的對照品貯備液于10 mL容量瓶中，分別制成蕓香苷、槲皮素、山萘酚濃度約為200、120、80 μg/mL的混合對照品使用液，然后用甲醇進行稀釋，經0.45 μm濾膜過濾，進樣20 μL，進行高效液相色譜(high performance liquid chromatography，簡稱HPLC)分析，繪制標準曲線圖。

供試樣品溶液制備：分別精確稱取苦蕎粉樣品約1 g，于85 ℃用90%甲醇索氏提取，旋轉蒸發(fā)濃縮于100 mL量瓶中，加甲醇定容，取1 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。吸取上述樣品，經0.45 μm濾膜過濾，進樣20 μL，進行色譜分析，用外標法計算樣品中的蕓香苷、槲皮素、山萘酚含量。

2 結果與分析

2.1 系統性試驗

分別精確吸取混合標準使用液、苦蕎供試品溶液各 20 μL，用LC-20A高效液相色譜儀進行測定，獲得液相色譜分離圖。由圖1可以看出，蕓香苷、槲皮素及山奈酚與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數、各色譜峰面積均超過10 000，溶劑對譜峰幾乎無干擾。

2.2 波長的選擇

通過UV-2450日本島津紫外可見分光光度計，在190～380 nm范圍內分別對混合對照品溶液中的蕓香苷、槲皮素和山奈酚色譜峰進行紫外掃描，結果顯示，上述3種成分均在280、365 nm附近有最大吸收，因此本研究選擇280、365 nm 2個波長，對樣品進行檢測。由于365 nm紫外光獲得的HPLC譜峰較好，因此最后選擇吸收波長為365 nm的紫外光對樣品進行檢測。

2.3 流動相選擇

在試驗過程中，采用甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.1%乙酸作為流動相，結果發(fā)現以甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸作為流動相的色譜峰存在拖尾現象，沒有達到理想的分離效果。而以甲醇-0.1%乙酸溶液作為流動相以后，可明顯改善HPLC色譜峰峰形，分離效果較好。因此，本研究最終選擇甲醇-0.1%乙酸溶液為流動相。

2.4 線性關系分析

分別精確量取適量混合標準品溶液，用甲醇進行稀釋，使各成分的濃度達到如下水平：蕓香苷，0.5、1、5、25、50、100、200 μg/mL；槲皮素，0.3、1.5、3、15、30、60、120 μg/mL；山萘酚，0.2、1、2、10、20、40、80 μg/mL。將各溶液注入液相色譜儀，按照設定色譜條件進行HPLC測定。平行進樣測定3次，以峰面積平均值y與進樣量x(μg)進行線性回歸，得回歸方程(表2)。

表2 蕓香苷、槲皮素、山奈酚線性回歸方程

結果表明，所得線性方程的相關系數均在0.99以上，表明曲線具有很好的線性關系。以2倍基線噪聲所對應的濃度計算出本方法中蕓香苷、槲皮素、山奈酚的檢出限分別為 0.011、0.004、0.004 μg，表明本方法的線性范圍較寬。

2.5 精密度試驗

精確吸取“1.2.3”節(jié)中的混合標準品溶液20 μL，按設定的色譜條件連續(xù)進樣6次，測得蕓香苷、槲皮素、山奈酚峰面積相對標準偏差(RSD)分別為0.29%、0.27%、0.28%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一批樣品芽苗粉，按照“1.2.2”節(jié)中的方法，平行制備4份供試樣品溶液，分別進樣測定。結果表明，蕓香苷、槲皮素、山奈酚平均含量分別為25.27、0.31、0.021 mg/g，相對標準偏差分別為2.22%、1.63%、2.37%(n=6)，表明本法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取芽苗粉，按照“1.2.3”節(jié)中的方法，配制供試樣品溶液，分別于制備后0、12、24、48 h進樣測定。結果表明，蕓香苷、槲皮素、山奈酚峰面積RSD分別為1.06%、1.31%、1.42%(n=6)，表明48 h內，供試樣品溶液可保持穩(wěn)定性。

2.8 加樣回收率試驗

在同一組容量瓶中，分別加入等量的芽苗粉樣品，然后再分別加入不同量的蕓香苷、槲皮素、山奈酚標準混合溶液，測定其回收率。結果表明，苦蕎粉中蕓香苷回收率為 97.77%～99.17%，槲皮素回收率為93.97%～97.99%，山奈酚回收率為96.76%～98.59%，RSD分別為0.71%、2.09%、0.94%(表3)，符合定量分析中準確度的要求，回收效果較好。

2.9 3種苦蕎粉中黃酮類物質含量測定

采用HPLC法，對芽苗粉、蕎麥葉粉、籽粒粉中的蕓香苷、槲皮素、山奈酚進行測定，利用外標法計算其含量。表4結果表明，蕓香苷在各種苦蕎粉中的含量高于槲皮素、山奈酚；蕓香苷、槲皮素在芽苗粉中的含量均高于蕎麥葉粉、籽粒粉，而山奈酚在籽粒粉中的含量最高，其次是芽苗粉，在蕎麥葉粉中山奈酚含量最低。

表4 不同來源苦蕎粉中黃酮類物質含量(n=4)

3 討論與結論

采用HPLC法，對用苦蕎籽粒、芽苗菜、蕎麥葉制作成的苦蕎粉中的蕓香苷、槲皮素、山奈酚進行精確定量分析，結果表明，蕓香苷、槲皮素含量在芽苗粉中的含量最高，在籽粒粉中含量最低。有研究發(fā)現，苦蕎籽粒在萌發(fā)過程中，一些活性成分如蕓香苷、槲皮素、D-手性肌醇等的含量會顯著上升，特別是蕓香苷，含量可上升十幾倍[6-8]。一般蕎麥種子在萌發(fā)過程中，苯丙氨酸解氨酶(PLA)活性上升，而黃酮類物質的含量隨著PLA活性增強而上升[9]，因此，苦蕎籽粒萌發(fā)成芽苗菜后，芽苗菜中的蕓香苷、槲皮素含量顯著上升。趙玉平等測定和分析了苦蕎麥不同器官中的黃酮含量差異，結果發(fā)現苦蕎葉片中的蕓香苷、槲皮素含量顯著高于籽粒[10-11]。因此可見，本試驗結果與前人的研究結果一致。

本研究表明，苦蕎籽粒粉中的山奈酚含量最高，然后是芽苗粉，蕎麥葉粉中的含量最低。這與夏清等的研究結果[12-13]類似，具體的原因有待進一步分析。

綜上所述，本研究建立的HPLC檢測體系，可應用于苦蕎粉中蕓香苷、槲皮素、山奈酚的精確定量分析，方法簡便快速，結果準確，且節(jié)省了時間，可用于苦蕎粉的質量控制。

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