miR-196a高表達(dá)在腎臟損傷中作用的分子生物學(xué)機(jī)制

李慧聰

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院，河南 開封 475000)

慢性腎臟損傷中腎小管間質(zhì)纖維化是共同病理特征，在原發(fā)性或繼發(fā)性腎臟疾病中，腎小管間質(zhì)纖維化程度是決定腎功能惡化水平的主要因素〔1〕。因此，早期抑制或逆轉(zhuǎn)腎小管間質(zhì)纖維化對延緩腎臟損傷向終末期發(fā)展具有重要意義。腎間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞是構(gòu)成胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞，腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化是病理狀態(tài)下肌成纖維細(xì)胞增多的主要機(jī)制之一〔2，3〕。相關(guān)研究顯示，腎小管間質(zhì)纖維化過程中腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化發(fā)揮重要作用，該過程在一定條件下具有可逆性〔4〕。但目前腎小管間質(zhì)纖維化的相關(guān)調(diào)控機(jī)制仍未明確，尚缺少有效的干預(yù)靶點(diǎn)。近年來研究發(fā)現(xiàn)miR-196a不僅對肝癌、胰腺癌等癌細(xì)胞具體調(diào)控作用，其高表達(dá)還可誘導(dǎo)腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化〔5，6〕；蛋白二硫化物異構(gòu)酶(PDI)A3是調(diào)控人線粒體氧化應(yīng)激的主要蛋白之一，前期生物信息學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)PDIA3可能為miR-196a的直接靶基因。本研究旨在驗(yàn)證miR-196a與PDIA3的互補(bǔ)配對關(guān)系，探討miR-196在腎小管間質(zhì)纖維化過程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人腎小管上皮細(xì)胞(HKC) 購于上海匹拓生物科技有限公司；清潔級ICR小鼠，7～9周齡，體質(zhì)量24～27 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；兔抗人α-血管平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)單克隆抗體、兔抗人PDIA3/ERp57多克隆抗體購于上海信裕生物科技有限公司、LNA修飾的anti-miR-196a、pre-miR-196a購于廣州賽誠生物科技有限公司。

1.2體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將HKC細(xì)胞株接種到含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。驗(yàn)證miR-196a是否參與調(diào)控腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的實(shí)驗(yàn)分組：常規(guī)培養(yǎng)組、TGF-β1組(5 ng/ml TGF-β1處理HKC細(xì)胞)、anti-miR-196a+TGF-β1組(LNA修飾的anti-miR-196a寡核苷酸200 nmol/L轉(zhuǎn)染HKC細(xì)胞24 h)。PDIA3為miR-196a對應(yīng)靶基因驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)分組：對照組(常規(guī)培養(yǎng))、pre-NC組、anti-NC組、pre-miR-196a組、anti-miR-196a組、TGF-β1組、pre-NC+TGF-β1組、anti-NC+TGF-β1組、pre-miR-196a+TGF-β1組、 anti-miR-196a+TGF-β1組。

1.2.2Western印跡檢測 離心收集各組細(xì)胞并提取總蛋白，定量后取50 μg行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，濕法轉(zhuǎn)膜；室溫孵育60min、洗膜、電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影。一抗為兔抗人α- SMA 單克隆抗體(1∶200)、兔抗人PDIA3/ERp57多克隆抗體(1∶500)、鼠抗人β-actin(1∶1 000)；二抗為辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗鼠抗體(1∶500)。

1.3體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.1小鼠單側(cè)輸尿管梗阻模型建立與分組 小鼠常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，全麻后鈍性游離左側(cè)輸尿管和腎臟，對左側(cè)輸尿管近腎盂端行結(jié)扎術(shù)；假手術(shù)組僅鈍性游離左側(cè)輸尿管。隨機(jī)分為：5 mg/kg及10 mg/kg干預(yù)組(輸尿管結(jié)扎前30 min，經(jīng)尾靜脈注射劑量為5、10 mg/kg LNA修飾的anti-miR-196a寡核苷酸)，陰性對照組(注射劑量為10 mg/kg LNA修飾的anti-negative-miR-196a)，模型組、假手術(shù)組、空白對照組，每組各5只。

1.3.2腎臟組織學(xué)檢查 腎組織經(jīng)10%甲醛固定后用石蠟包埋，3 μm切片、常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色。半定量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行腎小管間質(zhì)損傷、腎小球硬化評分，高倍鏡視野下選取20個(gè)無遮蓋皮質(zhì)視野，依據(jù)腎小管間質(zhì)損傷面積評分：0分(正常)、1分(損傷面積<10%)、2分(10%～25%)、3分(26%～50%)、4分(51%～70%)、5分(>70%)。每張切片觀察30個(gè)腎小球，依據(jù)硬化灶所占總面積比評分：0分(無病變)、1分(損傷面積<25%)、2分(25%～50%)、4分(51%～70%)、5分(>70%)，計(jì)算腎小球硬化指數(shù)。

1.3.3qRT-PCR檢測miR-196a表達(dá) 提取小鼠腎組織標(biāo)本總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，使用KAPA SYBR FAST 1-Step試劑盒進(jìn)行檢測，反應(yīng)體系25 μl，反應(yīng)條件：95℃ 2 min、95℃ 20 s、60℃ 15 s、72℃ 10 s，循環(huán)40次。miR-196a特異性擴(kuò)增引物由廣州賽誠生物科技有限公司設(shè)計(jì)完成。

1.3.4免疫組化檢測 SP法分析各組小鼠腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化相關(guān)標(biāo)志物〔α-SMA、波形蛋白(Vimentin)〕、PDIA3、硫氧還原蛋白(Trx)的表達(dá)水平。方法為：3 μm腎組織切片，微波修復(fù)抗原20 min，分別加入抗α-SMA(1∶100)、抗Vimentin(1∶100)、抗PDIA3(1∶200)、抗Trx(1∶150)，4℃孵育過夜，加二抗、室溫孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、蘇木素復(fù)染20 s，脫水、透明、中性樹脂封片，用Image J軟件進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-196a誘導(dǎo)腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞學(xué)研究 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，5 ng/ml的TGF-β1能夠上調(diào)miR-196a表達(dá)并誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化。TGF-β1組細(xì)胞中α-SMA表達(dá)量為1.75±0.32，明顯高于常規(guī)培養(yǎng)組的1.12±0.10，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。anti-miR-196a+TGF-β1組α-SMA表達(dá)量為1.43±0.32，明顯低于TGF-β1組(P<0.05)。

2.2PDIA3為miR-196a對應(yīng)靶基因 pre-miR-196a組細(xì)胞中PDIA3蛋白表達(dá)量為0.35±0.06，明顯低于pre-NC組的0.81±0.09(P<0.05)；anti-miR-196a+TGF-β1組PDIA3蛋白表達(dá)量為0.75±0.06，明顯高于anti-NC+TGF-β1組的0.39±0.04(P<0.05)；表明PDIA3為miR-196a對應(yīng)靶基因。見圖1。

1為對照組；2a為pre-NC組，2b為anti-NC組；3a為pre-miR-196a組，3b為anti-miR-196a組；4為TGF-β1組；5a為pre-NC+TGF-β1組，5b為anti-NC+TGF-β1組；6a為pre-miR-196a+TGF-β1組，6b anti-miR-196a+TGF-β1組圖1 各組PDIA3蛋白的Western印跡電泳圖

2.3小鼠梗阻側(cè)腎臟病理學(xué)改變 模型組和陰性對照組小鼠腎小管間質(zhì)損傷、腎小球硬化評分均明顯低于假手術(shù)組和空白對照組(P<0.01)；5、10 mg/kg干預(yù)組腎小管間質(zhì)損傷評分明顯低于模型組和陰性對照組(P<0.05)，其中以5 mg/kg干預(yù)組逆轉(zhuǎn)腎小管間質(zhì)纖維化作用更明顯。見表1、圖2。

2.4各組小鼠梗阻側(cè)腎組織miR-196a表達(dá)情況 模型組小鼠梗阻側(cè)腎組織miR-196a相對表達(dá)量為7.15±1.76，明顯高于假手術(shù)組的0.67±0.29(P<0.01)；5、10 mg/kg干預(yù)組小鼠梗阻側(cè)腎組織miR-196a相對表達(dá)量為3.14±0.61、4.36±3.72，明顯低于模型組(P<0.05)。

2.5腎臟組織免疫組化檢測 5、10 mg/kg干預(yù)組 α-SMA、Vimentin相對表達(dá)量明顯低于模型組、陰性對照組(P<0.05)；5、10 mg/kg干預(yù)組 PDIA3蛋白表達(dá)明顯高于模型組、陰性對照組(P<0.05)；5、10 mg/kg干預(yù)組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組小鼠腎組織損傷評分比較分，n=5)

與陰性對照組、模型組比較：1)P<0.05,2)P<0.01;下表同

圖2 各組小鼠腎組織病理學(xué)改變(HE染色，×400)

表2 各組小鼠腎組織α-SMA、Vimentin、PDIA3相對表達(dá)量比較

2.6miR-196a抑制腎組織抗氧化應(yīng)激反應(yīng) 以Trx為抗氧化應(yīng)激標(biāo)志物，免疫組化檢測顯示，模型組小鼠腎組Trx表達(dá)量0.17±0.10，明顯低于假手術(shù)組和空白對照組的0.75±0.16、0.69±0.13(P<0.05)；5、10 mg/kg干預(yù)組Trx表達(dá)量0.42±0.16、0.34±0.20，明顯高于模型組和陰性對照組0.17±0.10、0.15±0.08(P<0.05)。

3 討 論

miRNA可通過對靶mRNA的修飾來調(diào)控細(xì)胞多種生物學(xué)行為〔7〕。在miRNA調(diào)控腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的研究中，證實(shí)了miR-196a表達(dá)隨腎小管上皮細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的發(fā)生而明顯上調(diào)，當(dāng)抑制miR-196a表達(dá)后可部分逆轉(zhuǎn)腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示阻斷miR-196a表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)腎小管間質(zhì)纖維化，但非劑量依賴性。

miRNA的生物學(xué)效應(yīng)主要通過調(diào)控下游靶基因來實(shí)現(xiàn)〔8〕，前期生物信息學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的PDIA3是miR-196a預(yù)測靶基因之一；進(jìn)一步行體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pre-miR-196a可明顯抑制HPTC細(xì)胞中PDIA3蛋白表達(dá)量，轉(zhuǎn)染anti-miR-196a可有效逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的PDIA3表達(dá)下調(diào)。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中行5 mg/kg anti-miR-196a干預(yù)后，梗阻側(cè)腎組織中PDIA3蛋白表達(dá)上調(diào)，纖維化程度較模型組明顯減輕，提示PDIA3為miR-196a對應(yīng)靶基因，二者具有互補(bǔ)效應(yīng)。PDIA3是調(diào)控人線粒體氧化應(yīng)激的主要蛋白之一，本實(shí)驗(yàn)選取Trx為抗氧化反應(yīng)指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDIA3表達(dá)下調(diào)的同時(shí)伴隨著Trx表達(dá)下降，抑制miR-196a表達(dá)后，PDIA3表達(dá)上調(diào)的同時(shí)Trx也相應(yīng)升高；提示出現(xiàn)腎小管間質(zhì)纖維化時(shí)PDIA3表達(dá)下調(diào)并伴有腎組織抗氧化應(yīng)激能力減弱，抑制細(xì)胞抗氧化應(yīng)激是miR-196a參與腎臟損傷的重要機(jī)制之一。

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