不同劑量雷公藤多苷對小鼠結(jié)腸炎模型的作用及機制

張瑜鴻 苗新普

(海南省疾病預(yù)防控制中心門診內(nèi)科，海南 ?？?570203)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是結(jié)腸黏膜及黏膜下層常見的慢性非特異性炎癥反應(yīng)性疾病，臨床患者以腹痛、腹瀉、黏液膿血便等為主要表現(xiàn)，具有病程長、易反復(fù)、并發(fā)癥多、預(yù)后差等特征。歐美國家UC患病率較高，約為205/10萬～240/10萬，我國雖為UC的低發(fā)國家，但近年來UC的患病率亦呈不斷上升趨勢〔1，2〕。關(guān)于UC的病因及發(fā)病機制目前尚未明確闡明，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與腸黏膜的免疫反應(yīng)失衡密切相關(guān)〔3〕，近年來Toll樣受體(TLR)/核因子(NF)-κB信號通路在各類變應(yīng)性疾病發(fā)生機制中的作用受到廣泛關(guān)注〔4〕。雷公藤多苷是一類從衛(wèi)矛科植物雷公藤中提取精制的脂溶性混合物，具有顯著的免疫抑制、抗炎、抗腫瘤等功效〔5〕。有研究〔6〕指出，雷公藤多苷對UC小鼠具有顯著改善作用，其作用機制可能與TLR/NF-κB信號通路的激活，從而發(fā)揮免疫抑制作用有關(guān)。本研究通過建立小鼠UC模型，研究不同劑量雷公藤多苷對UC小鼠的作用效果，旨在探討雷公藤多苷對UC的作用機制，為制定UC的臨床治療方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選擇78只6～8周齡的SPF級BALB/c健康雄性小鼠，體質(zhì)量18～22 g。均由海南省疾病預(yù)防控制中心提供，動物使用許可證：SYXK(瓊)2015-0021。以基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，室溫(25.0±2.0)℃，濕度55%～70%，自然光照，保持室內(nèi)通風(fēng)，避免噪音。

1.2動物模型制備與分組 采用簡單隨機抽樣方法將78只小鼠分為正常對照組(NC組，n=10)、空白對照組(BC組，n=10)及模型組(n=58)。各組小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，NC組與BC組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)及自由飲用純凈水，模型組則采用自由飲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的葡聚糖硫酸鈉(DSS，購自美國Sigma-Aldrich公司)溶液以制備小鼠UC模型，持續(xù)7 d。每日觀察小鼠的糞便形狀、精神狀況及活動情況，記錄其體質(zhì)量的變化等。造模結(jié)束后第2日隨機處死模型組小鼠3只，分離腹部結(jié)腸組織，以生理鹽水沖洗干凈后肉眼下觀察結(jié)腸是否充血水腫，并在顯微鏡下觀察其組織病理學(xué)改變。模型組造模成功的依據(jù)為：表現(xiàn)為稀便、大便帶血(或隱血陽性)或體重減輕的三種癥狀之一者，且結(jié)腸組織呈現(xiàn)一定程度的形態(tài)及組織病理學(xué)改變。本次成模的小鼠共58只，成功率為100%。后將剩余的55只成模小鼠隨機分為模型對照組(MC組，n=10)、雷公藤多苷低劑量組(LD組，n=15)、雷公藤多苷中劑量組(MD組，n=15)和雷公藤多苷高劑量組(HD組，n=15)，其中LD組、MD組和HD組分別灌胃給予劑量為9.01、27.03和81.09 mg·kg-1·d-1的雷公藤多苷片(湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司，規(guī)格：10 mg×50片，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z43020138)混懸液(以蒸餾水配制成0.45、1.35、4.05mg/ml)，而MC組、NC組及BC組均灌胃等量的生理鹽水，1次/d，均持續(xù)7 d。第22日，除NC組外，均給予其余5組小鼠腹腔注射100 μg脂多糖(LPS)，以激活TLR4/NF-κB信號通路并啟動下游炎癥因子的釋放，24 h后處死小鼠，剖腹剪取結(jié)腸組織，摘取肉眼下所見病變最明顯處的結(jié)腸組織，一部分用于制備組織切片進行病理學(xué)觀察，另一部分制成組織勻漿，-80℃凍存，待測。

1.3觀察指標(biāo)與方法

1.3.1各組小鼠結(jié)腸組織的組織形態(tài)學(xué)評分 肉眼下觀察結(jié)腸組織中黏膜層及漿膜層的變化，切取距肛門約8 cm的遠(yuǎn)端結(jié)腸組織，大小約為2.0 cm×2.0 cm，以10%的中性甲醛液固定24 h后行常規(guī)石蠟包埋，以切片機制成厚度3～4 μm的連續(xù)切片，蘇木素-伊紅(HE)染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠的結(jié)腸組織病理學(xué)表現(xiàn)。參照相關(guān)文獻〔7〕，對各組小鼠結(jié)腸組織的大體形態(tài)改變及組織病理學(xué)損傷進行評分。

1.3.2各組小鼠結(jié)腸組織中TLR4蛋白的表達(dá) 采用蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)腸組織勻漿中TLR4的表達(dá)水平，主要操作過程包括：取100 mg左右結(jié)腸組織，剪碎后加入適量冰磷酸鹽緩沖液(PBS)置于勻漿器中進行研磨，滴加蛋白裂解液和PMSF提取組織中的總蛋白。經(jīng)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后采用甲醇浸泡、緩沖液平衡、轉(zhuǎn)移、脫色等操作，后加入5%的脫脂奶粉進行封閉，4℃過夜后迅速加入一抗(TLR4小鼠單克隆抗體，以封閉液稀釋濃度為1∶500，晶美公司)，搖床孵育2 h，4℃過夜、TBS液洗滌4次，各10 min。加入二抗(以封閉液稀釋濃度為1∶2 000，晶美公司)，封閉、室溫?fù)u床孵育1 h，TBS液洗滌4次，各10 min。加入底物孵育，清除硝酸纖維素膜，以蒸餾水漂洗、晾干，采用Fluor-s凝膠成像系統(tǒng)(環(huán)亞生物科技有限公司)分析目的蛋白條帶的灰度值，計算其相對含量。

1.3.3各組小鼠結(jié)腸組織中NF-κB p65的表達(dá) 采用免疫組化EnVision二步法進行檢測，主要操作有：將結(jié)腸組織切片進行脫蠟、水化、熱修復(fù)等處理后，滴入1滴3%的H2O2，室溫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物的活性。PBS沖洗3次，各3 min，晾干，滴加一抗(NF-κB p65兔多克隆抗體，濃度稀釋為1∶500，北京博奧森生物公司)，4℃靜置孵育1 h后，以PBS洗滌3次，各5 min；滴加山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G-辣根過氧化物酶(HRP)多聚體(稀釋倍數(shù)為1∶2 000，北京索萊寶科技有限公司)，搖床孵育40 min后，以蒸餾水洗滌3次，各5 min。每張切片滴加1滴新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)液顯色3 min，顯微鏡下觀察5 min，流水沖洗終止顯色，蒸餾水漂洗后以蘇木素復(fù)染、0.1%HCl分化、梯度酒精脫水、中性樹膠封片。晾干后由2名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師采用盲法對切片結(jié)果進行判斷，評估方法參照相關(guān)文獻〔8〕，根據(jù)陽性細(xì)胞(即胞質(zhì)或胞核呈黃色或棕色的細(xì)胞)所占百分比及其染色強度對免疫組化結(jié)果進行評分(IHC評分)。IHC評分越高，說明結(jié)腸組織中NF-κB p65的表達(dá)水平越高。

1.3.4各組小鼠結(jié)腸組織中促炎因子的表達(dá) 各組小鼠結(jié)腸組織中白細(xì)胞介素(IL)-1α、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-13的濃度檢測方法為酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，操作過程主要有：剪取100 mg左右結(jié)腸組織，迅速置于液氮中冷卻，切成2～3 mm3的小塊，在組織勻漿器中加入預(yù)冷的50 mmol/L PBS液(pH6.0)進行研磨，在4℃超低溫高速離心機中進行離心，14 000 r/min離心10 min，分離上層液體，存于-80℃冰箱中。IL-1α、TNF-α、IL-13的測定嚴(yán)格按照ELISA試劑盒(上海信帆生物科技有限公司)說明書進行。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠結(jié)腸組織的病理學(xué)表現(xiàn)及組織形態(tài)學(xué)評分比較 顯微鏡下對各組小鼠的結(jié)腸組織切片進行觀察，可見BC組及NC組結(jié)腸組織黏膜光滑、完整，腺體結(jié)構(gòu)清晰，未見水腫、潰瘍及炎細(xì)胞浸潤等炎癥反應(yīng)；MC組結(jié)腸組織呈典型的UC病理表現(xiàn)，即黏膜呈明顯充血水腫、糜爛、潰瘍等表現(xiàn)，潰瘍周邊腺體結(jié)構(gòu)紊亂且異常增生，黏膜及黏膜下層可見淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤；各組雷公藤多苷組小鼠結(jié)腸組織炎性改變較MC組呈現(xiàn)不同程度的減輕，LD組發(fā)生的炎癥反應(yīng)較MD組及HD組更嚴(yán)重，HD組炎癥反應(yīng)改善狀況最明顯。各組小鼠形態(tài)學(xué)評分結(jié)果示，各模型組小鼠的大體形態(tài)學(xué)評分及組織損傷評分均顯著高于BC組及NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而BC組與NC組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；各模型組小鼠中，LD組、MD組和HD組的評分均低于MC組，且HD組

2.2各組小鼠結(jié)腸組織中TLR4及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較 各模型組小鼠結(jié)腸組織中的TLR4含量及NF-κB p65 IHC評分均顯著高于BC組和NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而BC組與NC組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；各模型組小鼠中，LD組、MD組和HD組的評分均低于MC組，且HD組

表1 各組小鼠結(jié)腸組織的組織形態(tài)學(xué)評分比較

與BC組及NC組比較:1)P<0.05；與MC組比較:2)P<0.05；與LD組比較:3)P<0.05；與MD組比較:4)P<0.05；下表同

表2 各組小鼠結(jié)腸組織中TLR4及NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平及IL-1α、TNF-α、IL-13的濃度比較

2.3各組小鼠結(jié)腸組織中IL-1α、TNF-α、IL-13的濃度比較 各模型組小鼠結(jié)腸組織中IL-1α、TNF-α的濃度均高于BC組和NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而BC組和NC組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；各模型組小鼠中，LD組、MD組、HD組小鼠IL-1α、TNF-α濃度均低于MC組，且HD組0.05)。見表2。

3 討 論

UC是結(jié)直腸部位發(fā)生的一種自身免疫性疾病，病變呈彌漫性改變，多由直腸段開始，累及全段結(jié)腸，內(nèi)鏡下可見腸壁黏膜多發(fā)性潰瘍、周圍組織充血水腫?；颊叨嘁圆∫虿幻髑疫w延不愈的腹痛、腹瀉、便血為主要臨床表現(xiàn)。據(jù)統(tǒng)計，隨著經(jīng)濟的發(fā)展及居民飲食習(xí)慣等因素的改變，我國UC患病率已超過11.6/10萬，成為腸道主要疾病之一，且UC還可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程〔9〕。而目前臨床藥物對于UC的治療效果并不理想，且存在復(fù)發(fā)率高、不良反應(yīng)多、不宜長期服用等缺陷〔10〕，雷公藤多苷是從中藥雷公藤中精煉分離得到的抗炎物質(zhì)，主要由二萜內(nèi)酯、生物堿及三萜內(nèi)酯等生物學(xué)活性成分組成，素有“中草藥激素”之稱，在風(fēng)濕、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎、小兒紫癜等免疫性疾病的治療中發(fā)揮重要作用〔11〕。

目前對于UC的病因及發(fā)病機制尚不明確，學(xué)者普遍認(rèn)為其發(fā)生發(fā)展涉及遺傳、地域、免疫、環(huán)境、腸道菌群、飲食習(xí)慣等多種因素〔12〕，其中免疫因素在其中發(fā)揮主導(dǎo)作用。近年來TLRs/NF-κB信號通路在各類變應(yīng)性疾病發(fā)生機制中的作用成為學(xué)者們研究的焦點。TLRs是一類Ⅰ型細(xì)胞跨膜蛋白，廣泛表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞中，也可表達(dá)于表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等非免疫細(xì)胞中。其可通過識別細(xì)菌、病毒等外源性配體及宿主自身釋放的熱休克蛋白、透明質(zhì)酸等內(nèi)源性配體，并與之結(jié)合，啟動細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的免疫平衡〔13〕。TLR4是首個被發(fā)現(xiàn)的TLRs，是介導(dǎo)內(nèi)毒素/LPS發(fā)生應(yīng)答反應(yīng)的最重要受體。人類正常結(jié)腸上皮細(xì)胞中，TLR4呈低表達(dá)且TLR4信號通路中的關(guān)鍵共受體MD2不表達(dá)。因此正常腸黏膜對LPS呈低反應(yīng)性；而當(dāng)結(jié)腸黏膜出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時TLR4呈高表達(dá)狀態(tài)〔14〕。NF-κB是一類廣泛存在于人體細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)錄因子，在人體的生長發(fā)育、炎癥反應(yīng)、損傷修復(fù)等活動中發(fā)揮重要調(diào)控作用〔15〕。通常情況下其由P50和P65兩種亞基組成，其中P65是其主要活性成分。靜息狀態(tài)下，NF-κB與IκB-α以非共價鍵的形式結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)以失活狀態(tài)存在；而當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時，IκB激酶被激活并降解IκB蛋白，從而解離NF-κB與IκB-α的結(jié)合物，使NF-κB活化并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)與靶基因DNA結(jié)合，進而發(fā)揮促進細(xì)胞增殖及炎癥因子釋放等多種生物學(xué)功能，炎癥因子的分泌與表達(dá)可進一步激活NF-κB，使其形成正反饋調(diào)節(jié)，放大炎癥反應(yīng)〔16〕。

本實驗結(jié)果顯示說明雷公藤多苷對UC小鼠的結(jié)腸組織病理損傷具有顯著改善作用，且其改善作用與雷公藤多苷的劑量有關(guān)，高劑量組改善效果更為明顯。本文進一步對雷公藤多苷的作用機制進行研究，結(jié)果說明小鼠在UC狀態(tài)時，結(jié)腸黏膜的TLR4/NF-κB p65信號通路可被激活，從而促進其下游促炎癥因子的釋放；雷公藤多苷可對UC小鼠的TLR4/NF-κB p65信號通路產(chǎn)生抑制作用，下調(diào)其下游促炎癥因子，而對抗炎細(xì)胞因子IL-13不產(chǎn)生調(diào)控作用。

綜上所述，不同劑量雷公藤多苷可對UC小鼠的結(jié)腸組織損傷具有不同程度的保護作用，且高劑量組效果更顯著，而最佳適宜劑量仍需進一步研究。其保護作用機制可能與其對TLR4/NF-κB p65通路的抑制作用，進而下調(diào)其下游促炎癥因子IL-1α、TNF-α的分泌和表達(dá)有關(guān)。

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