核酸雜交檢測在細菌性陰道病及外陰陰道假絲酵母菌病診斷中的應用價值

李田 李小毛 丁杰 黃敏 禹夜

中山大學附屬第三醫(yī)院（廣州 510630）

陰道炎是婦產(chǎn)科常見病之一，最常見的是細菌性陰道?。╞acterial vaginosis，BV）和外陰陰道假絲酵母菌?。╲ulvovaginal candidiasis，VVC）。兩種疾病的發(fā)生均與陰道微生態(tài)平衡破壞相關(guān)。細菌性陰道病時，陰道內(nèi)的乳酸桿菌減少，導致其他微生物大量繁殖，主要有加德納菌、厭氧菌（動彎桿菌、普雷沃菌、紫單胞菌、類桿菌、消化鏈球菌等）以及人型支原體，其中以厭氧菌居多［1-2］。Nugent評分法診斷細菌性陰道病在靈敏性、特異性、客觀性及可重復性方面均相對較好，但因革蘭染色自身技術(shù)的局限性，對工作人員自身素質(zhì)要求高，使其在臨床應用受限。Amsel法是臨床常用檢查方法之一，但由于主觀因素強、需要人為的工作較多，越來越多的醫(yī)生開始使用快速診斷試劑，例如BV藍試劑，主要通過酶法間接診斷。外陰陰道假絲酵母菌病是第二種常見的陰道炎，真菌涂片鏡檢和真菌培養(yǎng)法是真菌學檢驗的基本方法，由于真菌培養(yǎng)可提高病原體的檢出率、鑒定菌種和進行藥敏試驗，故其目前仍是診斷真菌感染的“金標準”［3］。但培養(yǎng)法耗時，不宜做為門診常規(guī)檢查。近年來分子診斷廣泛應用，與傳統(tǒng)檢測比較，分子診斷在陰道炎診斷中的優(yōu)勢明顯［4］。AffirmTMVPIII是一種通過DNA探針技術(shù)，以核酸雜交原理為基礎(chǔ)，對臨床具有陰道炎或陰道病癥狀患者的分泌物進行檢測和識別陰道加德納菌屬，念珠菌屬和滴蟲的核酸的試劑。該檢測方法于2015年美國CDC［3］推薦使用，但國內(nèi)應用少，本文將傳統(tǒng)的陰道炎檢測方法與之比較，探討其臨床應用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2017年8月中山大學附屬第三醫(yī)院婦科門診具有陰道炎癥狀或體征的女性患者共103例。所有患者檢測時均排除月經(jīng)、妊娠、24 h內(nèi)有性生活，72 h內(nèi)有陰道沖洗以及1周內(nèi)受過抗真菌、抗加德納菌、抗滴蟲的治療。

1.2 標本采集在樣本采集試管上貼上患者識別信息標簽，標注樣本采集時間。以盆腔檢查體位安置患者，插入陰道窺器，以便能夠看到陰道后穹窿。使用無菌棉簽從陰道后穹窿采集標本，將棉簽在陰道壁上轉(zhuǎn)動或滾動2～3次，確保棉簽的整個外周都已經(jīng)接觸過陰道壁。對于每個測試者，共使用4根無菌拭子分別從每位患者陰道后穹隆左右兩側(cè)取樣。第1個取樣拭子放入Affirm樣本收集管中，室溫下保存1 h之內(nèi)進行測試。樣本管加入裂解溶液之后，85℃裂解10 min，再加入緩沖溶液。將處理好的樣本溶液轉(zhuǎn)移入反應槽中，再在相應的孔位中加上底物溶液和探針分析卡（PAC），反應槽裝入儀器進行自動運行。檢測完成把PAC從儀器上取下進行結(jié)果判讀。第2個取樣拭子存放在無菌試管中，加入稀釋液，然后把該拭子滾動涂布于2張玻片，一張用于用于線索細胞、真菌孢子和假菌絲的觀察，一張用于Nugent評分。第3個取樣拭子進行BV藍試劑檢測。第4個取樣拭子行真菌顯色培養(yǎng)。

1.3 檢測方法

1.3.1 AffirmTMVPIII（由 Becton，Dickinson and Company提供）分析卡PACs陰性對照為無色，陽性對照為藍色，則3種微生物的微球上顯示藍色為陽性，無色為陰性。

1.3.2 生理鹽水涂片由固定的高年資檢驗師進行檢查，顯微鏡下觀察線索細胞、真菌孢子和假菌絲，以及滴蟲。

1.3.3 Nugent評分使用珠海貝索生物技術(shù)有限公司的快速革蘭氏染色液（Rapid Gram Stain），檢驗方法：標本薄而均勻地涂在玻片上，加龍膽紫液染色10 s，之后水洗，甩干；加碘溶液染色10 s，之后水洗，甩干；加脫色液脫色10～20 s，之后水洗，甩干；最后加沙黃溶液復染10s，之后水洗干燥。Nugent評分0～3分，為正常；4～6分，診斷中間型BV；≥7分，診斷BV。

1.3.4 BV藍檢測（愛必維試劑盒，由北京中生金域公司提供）把受試者的陰道分泌物置入試管內(nèi)，在試管中滴入黃色稀釋液6～18滴，在反應裝置的5個孔內(nèi)的每個孔中加入經(jīng)處理過的樣品1滴，當內(nèi)容物超過反應孔的一半為最適宜位置，隨后把“顯色液A”滴入“唾液酸苷酶”反應孔內(nèi)，大約1滴。把反應裝置置入溫度為37℃的水浴箱，顯色后對其結(jié)果進行記錄。

1.3.5 真菌培養(yǎng)采用真菌顯色（真菌顯色平板由江門市凱林貿(mào)易有限公司提供）培養(yǎng)法，把陰道分泌物標本接種于顯色培養(yǎng)基上，25～28℃培養(yǎng)48 h后，有菌落生長為陽性，未培養(yǎng)出菌落為陰性。

1.4 統(tǒng)計學方法以Nungent評分和真菌培養(yǎng)法作為細菌性陰道病及外陰陰道假絲酵母菌病的診斷金標準，分別計算AffirmTMVPIII及常用檢驗方法（濕片鏡檢，BV藍試劑）與金標準相對比較的敏感性及特異性。采用Kappa檢驗分別計算AffirmTMVPIII的檢測結(jié)果與常用檢驗方法（濕片鏡檢，BV藍試劑）的一致性。Kappa＞0，此時說明有意義，Kappa愈大，說明一致性愈好；Kappa≥0.75時，兩者一致性較好，0.4≤Kappa＜0.75時，兩者一致性一般；Kappa＜0.4時，兩者一致性差。

2 結(jié)果

2.1 樣本檢測分布本次實驗共采集103例有效標本評價AffirmTMVPIII檢測方法的應用價值。入組人群中各種感染的比例（金標準方法）見表1、2，BV占48.5%，VVC占38.8%，其中混合感染總共有24例，占有效樣本的23.3%。AffirmTMVPIII檢測對混合感染的檢出準確率為83.3%，濕片鏡檢的準確率為70.3%。

表1 不同檢測方法的細菌性陰道病及外陰陰道假絲酵母菌病陽性率分布Tab.1 Distribution of positive rates of BV and VVC in different detection methods 例（%）

2.2 AffirmTMVPIII及常用檢測方法與金標準方法對比針對細菌性陰道病，以Nugent評分結(jié)合臨床癥狀為金標準，對比AffirmTMVPIII和濕片鏡檢、BV藍試劑的檢出一致性。AffirmTMVPIII檢測的靈敏性、特異性和準確性最高，BV藍試劑檢測的準確性最低。見表3、4。

表2 入組人群各種感染的具體分布Tab.2 Specific distribution of various viginitis in the group

表3 細菌性陰道病各種診斷方法與金標準方法的對比Tab.3 Comparison of various diagnostic methods and gold standard methods of BV 例

表4 細菌性陰道病各種診斷方法與金標準方法對比的敏感性、特異性和準確性Tab.4 Sensitivity，specificity and accuracy of various diagnostic methods compared with gold standard methods of BV%

針對外陰陰道念珠菌病，以真菌培養(yǎng)結(jié)合臨床癥狀為金標準，對比AffirmTMVPIII和濕片鏡檢的檢出率（表5、6），Affirm與鏡檢方法的靈敏性、特異性和準確性均較高。所有的念珠菌感染中，白色念珠菌占92.1%，非白色念珠菌占7.9%。

表5 外陰陰道念珠菌病各種診斷方法與金標準方法的對比Tab.5 Comparison of various diagnostic methods and gold standard methods of VVC 例

表6 外陰陰道念珠菌病各種診斷方法與金標準方法對比的敏感性、特異性和準確性Tab.6 Sensitivity,specificity and accuracy of various diagnostic methods compared with gold standard methods of VVC %

3 討論

本研究中門診擬診陰道炎的患者中，BV占48.5%，VVC占38.8%，其中混合感染總共有24例，占有效樣本的23.3%，4例為滴蟲性陰道炎與細菌性陰道病混合感染，細菌性陰道病的發(fā)生率最高，與國內(nèi)外文獻報道基本一致［5-6］。BV是以加德納菌為主的一種混合感染，是陰道分泌物或惡臭的最普遍的原因。然而，調(diào)查顯示，大多數(shù)BV患者無癥狀。研究［7-8］表明，BV可能是由大量具有促炎癥特征的細菌引起的，宿主免疫功能異常所導致的免疫反應。合并BV的婦女其婦科術(shù)后并發(fā)癥、妊娠合并癥［9-10］風險增加，感染其他性傳播疾?。⊿TD）如人免疫缺陷病毒（HIV）、淋病奈瑟菌、沙眼衣原體和單純皰疹病毒Ⅱ型（HSV-2）等風險增大［11］。提高BV的診斷水平，可使疾病得到及時的控制。對于BV的實驗室診斷，本研究以Nugent評分法為金標準，AffirmTMVPIII檢測的一致性最高，Kappa系數(shù)高達0.94，多項研究結(jié)果也顯示AffirmTMVPIII的診斷更加客觀和靈敏［12-13］，這一點也在本試驗數(shù)據(jù)中得到了反映。2015年美國CDC［3］推薦AffirmTMVPIII可用于診斷BV。

AffirmTMVPIII核酸雜交法可準確識別有BV臨床診斷意義的加德納菌（濃度≥2×105CFU/mL陰道液）。BV藍試劑是通過檢測唾液酸苷酶活性來診斷BV，陰道微生態(tài)菌群中，普雷沃菌和擬桿菌是唾液酸苷酶活性增加的主要病原菌，部分加德納菌有此酶活性，而動彎桿菌、消化球菌以及人型支原體的此酶活性基本不能檢出。BV是多種厭氧細菌增多引起的，單純依靠檢測分泌物中唾液酸苷酶的活性，必然會導致漏檢由唾液酸苷酶活性低的厭氧細菌增多引起的BV［14］。而AffirmTMVPIII可以檢測出一定濃度的普雷沃菌、擬桿菌、動彎桿菌和支原體，漏診的幾率較單純唾液酸苷酶檢測小。

VVC是第二常見陰道感染性疾病，真菌培養(yǎng)法是金標準，但培養(yǎng)法耗時較長，不能快速獲得培養(yǎng)結(jié)果。臨床上濕片和涂片鏡檢是主要的檢查方法。本研究以培養(yǎng)法為金標準，對比AffirmTMVPIII和濕片的檢出率，兩者與金標準比較的一致性都較好，Kappa系數(shù)分別為0.91和0.94。鏡檢方法容易受樣本中干擾物質(zhì)影響，觀察者的經(jīng)驗以及細心檢查很重要。本研究中的鏡檢由高年資檢驗師完成，與培養(yǎng)法比較，一致性高。AffirmTMVPIII可識別白色、光滑、熱帶、克柔、克菲、近平滑6種念珠菌，同樣可以達到與培養(yǎng)法比較一致率高的檢測水平，在大樣本檢測且人力不足的情況下可以替代鏡檢，檢測客觀敏感。

對于滴蟲性陰道炎的診斷，本研究病例數(shù)不多，常用的濕片法檢測敏感性低（51%～65%），在分子檢測方法出現(xiàn)以前培養(yǎng)是金標準診斷方法，目前分子檢測在滴蟲的診斷中得到肯定，AffirmTMVPIII已被FDA批準用于滴蟲性陰道炎的診斷［3］。

Affirm核酸雜交技術(shù)是DNA探針與目標RNA雜交，顯色探針上連接的酶與底物反應，反應不需要擴增，環(huán)境里的極少量的核酸和微生物基本無干擾，病原體數(shù)量達到一定的（BV：2×105cfu；VVC：1×104cfu；TV：5×103cfu）顯示陽性，避免了結(jié)果過于靈敏導致的誤判。該檢測技術(shù)一次取樣可檢測最常見的3種陰道炎癥，全程自動化的處理和讀取樣本，摒棄了樣本遞送和顯微鏡觀測的人為因素，確保診斷結(jié)果的全面、準確和穩(wěn)定，本研究顯示核酸雜交檢測對混合感染的檢出準確性明顯高于鏡檢。

綜上所述，AffirmTMVPIII核酸雜交檢測在BV的診斷方面優(yōu)勢明顯，在VVC診斷方面與濕片鏡檢相當，與真菌培養(yǎng)比較準確性高，雖然該檢測成本較高，但其診斷快速、重復性高，對混合感染及疑難病例仍有較高的臨床應用價值。

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