新型乙型肝炎病毒基因分型檢測(cè)試劑盒的臨床評(píng)價(jià)

劉立明,趙曉茹,夏利芳,王 童,劉亞楠,任 君,郭桐生▲

(1.北京小湯山醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京 102212；2.中國人民解放軍第三○二醫(yī)院,北京 100039； 3.中國人民解放軍第三二四醫(yī)院,重慶 400020)

乙型肝炎病毒(HBV)屬于嗜肝DNA 病毒，HBV復(fù)制過程中易發(fā)生核苷酸錯(cuò)誤配對(duì)，導(dǎo)致同一病毒核苷酸序列的差異，表現(xiàn)為HBV不同的基因型[1]。根據(jù)HBV全基因序列異質(zhì)性大于或等于8%或S區(qū)基因序列異質(zhì)性大于或等于4%，可分為A～I(xiàn) 9種基因型[2]。有研究報(bào)道HBV基因型與乙型肝炎的疾病進(jìn)程、臨床表現(xiàn)、預(yù)后與抗病毒治療應(yīng)答等密切相關(guān)[3-5]。目前臨床基因分型方法有基因測(cè)序法、限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)分析法、型特異性引物PCR法、基因芯片法等[6-8]。此類方法操作過程均較繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件和人員要求較高，臨床普及困難。本研究探討HBV基因分型檢測(cè)試劑盒采用熒光免疫技術(shù)，基于雙抗加心法，操作簡便，同時(shí)以實(shí)時(shí)熒光PCR法為對(duì)照，對(duì)該試劑(以下簡稱驗(yàn)證試劑)進(jìn)行臨床驗(yàn)證評(píng)價(jià)，探索一種高效、準(zhǔn)確、易于普及的HBV基因型分型方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集解放軍302醫(yī)院臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心分子診斷室研究對(duì)象的血清333例，50例配對(duì)的血清和血漿，―20 ℃凍存。

1.2儀器與試劑 驗(yàn)證試劑為HBV基因分型檢測(cè)試劑盒(熒光免疫層析法)(北京萬泰，批號(hào)BGFC20141204)，對(duì)應(yīng)儀器采用RTR-FS100熒光掃描分析儀；對(duì)照試劑為HBV基因分型測(cè)定試劑盒(熒光PCR法)，試劑盒內(nèi)含HBV B、C質(zhì)粒陽性質(zhì)控(上海之江，H20150701)；對(duì)應(yīng)儀器采用SLAN熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)及相應(yīng)軟件?；驕y(cè)序法使用第1代測(cè)序方法，均由上海生工公司完成。

1.3方法

1.3.1驗(yàn)證試劑 (1)原理：采用熒光免疫技術(shù)和雙抗體夾心法，硝酸纖維素膜檢測(cè)區(qū)分別包被抗-HBsAg抗體、抗-A型HBV抗體、抗-B型HBV抗體、抗-C型HBV抗體、抗-D型HBV抗體，玻璃纖維墊上包被熒光標(biāo)記HBsAb。檢測(cè)時(shí)標(biāo)本HBV與熒光標(biāo)記抗體結(jié)合在毛細(xì)作用下沿膜移動(dòng)，與固定在膜上的包被抗體形成復(fù)合物，通過檢測(cè)儀定性分析基因型。(2)操作：取80 μL血清或血漿標(biāo)本置入試劑加樣區(qū)，20 min后熒光掃描分析儀讀取分型結(jié)果。

1.3.2對(duì)照試劑操作 提取核酸-配制試劑-加樣-PCR擴(kuò)增；循環(huán)參數(shù)設(shè)置：37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min，再按94 ℃ 10 s，62 ℃ 40 s，循環(huán)40次，單點(diǎn)熒光檢測(cè)為62 ℃，反應(yīng)體系為40 μL，熒光通道檢測(cè)選擇FAM通道。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算驗(yàn)證試劑與對(duì)照試劑檢測(cè)結(jié)果的符合率及其95%CI，并計(jì)算Kappa值分析結(jié)果的一致性。

2 結(jié) 果

2.12種方法檢測(cè)A基因型結(jié)果 A基因型血清標(biāo)本驗(yàn)證試劑檢出15例，對(duì)照方法檢出12例，2種方法的符合率為15/12。B基因型血清標(biāo)本驗(yàn)證試劑與對(duì)照試劑結(jié)果的陽性符合率為98.00%，陰性符合率為99.06%，總符合率98.91%。95%CI：97.24%～99.70%，Kappa值為0.954，一致性最強(qiáng)。C基因型血清標(biāo)本驗(yàn)證試劑與對(duì)照試劑結(jié)果的陽性符合率為98.78%，陰性符合率為86.99%，總符合率94.84%。95%CI：92.05%～96.86%、Kappa值為0.881，一致性最強(qiáng)。D基因型血清標(biāo)本驗(yàn)證試劑與對(duì)照試劑結(jié)果的陽性符合率為87.50%，陰性符合率為100.00%，總符合率99.73%。95%CI：98.50%～99.99%，Kappa值為0.932，一致性最強(qiáng)。見表1～3。

2.22種方法不一致標(biāo)本的第3方檢測(cè)結(jié)果 驗(yàn)證試劑與對(duì)照試劑有28例血清標(biāo)本HBV 基因型檢測(cè)結(jié)果不一致，采用第3方基因序列檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證，其結(jié)果與驗(yàn)證試劑一致標(biāo)本17例，不一致11例。見表4。

2.3驗(yàn)證試劑對(duì)相同血清和血漿標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果 驗(yàn)證試劑對(duì)同一例血清、血漿標(biāo)本檢測(cè)B基因型結(jié)果的陽性符合率為100.00%，陰性符合率為100.00%，總符合率100.00%，95%CI：92.89%～100.00%，Kappa值為1.000，一致性最強(qiáng)。驗(yàn)證試劑對(duì)同一例血清、血漿標(biāo)本檢測(cè)C基因型結(jié)果的陽性符合率為100.00%，陰性符合率為100.00%，總符合率100.00%，95%CI：92.89%～100.00%，Kappa值為1.000，一致性最強(qiáng)。見表5、6。

表1 2種方法檢測(cè)B基因型血清標(biāo)本的結(jié)果比較(n)

表2 2種方法檢測(cè)C基因型血清標(biāo)本的結(jié)果比較(n)

表3 2種方法檢測(cè)D基因型血清標(biāo)本的結(jié)果比較(n)

表4 2種方法的不一致標(biāo)本第3方檢測(cè)結(jié)果比較

表5 驗(yàn)證試劑檢測(cè)相同血清、血漿B基因型標(biāo)本的結(jié)果比較(n)

表6 驗(yàn)證試劑檢測(cè)相同血清、血漿C基因型標(biāo)本的結(jié)果比較(n)

3 討 論

目前普遍認(rèn)為基因型C型引起的炎性壞死及纖維化程度比B型更嚴(yán)重，HBV e抗原陽性率更高，平均年齡高于B型，且C型與肝硬化、肝癌有關(guān)；基因型B型的累積生存率明顯高于C型，基因型D型易在年輕患者中發(fā)生原發(fā)性肝細(xì)胞癌，F(xiàn)型比A、D型更易引起與肝臟疾病相關(guān)的病死率[9-11]。因此，臨床開展HBV 基因分型檢測(cè)對(duì)患者十分必要，但目前分型方法實(shí)驗(yàn)條件較高且難以普及，尋找一種高效、準(zhǔn)確、簡便的HBV基因型分析方法對(duì)基層臨床實(shí)驗(yàn)室至關(guān)重要。

國家食品藥品監(jiān)督局注冊(cè)的HBV基因分型檢測(cè)試劑盒共有7個(gè)生產(chǎn)廠家，主要以PCR產(chǎn)品、測(cè)序法、反向點(diǎn)雜交為主，且主要檢測(cè)B、C基因型，僅有上海之江和廈門泰普的產(chǎn)品可以檢測(cè)B、C、D基因型，未有可同時(shí)檢測(cè)A、B、C、D基因型的上市批準(zhǔn)產(chǎn)品。血清學(xué)方法檢測(cè)基因分型是以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)，具有經(jīng)濟(jì)、易操作、高通量等優(yōu)點(diǎn)。有研究報(bào)道，PCR檢測(cè)技術(shù)分型的陰性患者35%可使用血清學(xué)分型技術(shù)檢測(cè)，血清學(xué)分型要優(yōu)于PCR技術(shù)。本研究結(jié)果表明，18例患者使用PCR技術(shù)無法分型，但采用血清學(xué)方法能夠分型。也有研究顯示，血清學(xué)分不出型別的標(biāo)本比例高達(dá)23.4%。本研究有9例患者無法分型，

本研究試劑盒以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)，采用熒光免疫技術(shù)和雙抗體夾心法，在硝酸纖維素膜檢測(cè)區(qū)分別包被抗-HBV表面抗原抗體、抗-A型HBV抗體、抗-B型HBV抗體、抗-C型HBV抗體、抗-D型HBV抗體，玻璃纖維墊上包被熒光標(biāo)記的HBV表面抗體。檢測(cè)時(shí)標(biāo)本置入試劑加樣區(qū)，標(biāo)本中的HBV與熒光標(biāo)記抗體結(jié)合，在毛細(xì)作用力下沿膜移動(dòng)，與固定在膜上的包被抗體形成復(fù)合物，通過熒光掃描分析儀定性分析HBV基因型。

本研究以測(cè)序法作為參比方法，驗(yàn)證萬泰新試劑對(duì)A基因型的檢出性能，且驗(yàn)證試劑和對(duì)照試劑(B、C、D基因型)對(duì)血清標(biāo)本中HBV基因分型的試驗(yàn)結(jié)果之間具有較好的符合程度，臨床應(yīng)用中兩者具有等效性。383例標(biāo)本中，有28例檢測(cè)結(jié)果不一致，但以參比方法為準(zhǔn)，28例標(biāo)本有17例與參比方法一致，另外11例標(biāo)本有2例是混合感染導(dǎo)致結(jié)果不一致。相對(duì)于對(duì)照方法所需的較高試驗(yàn)條件、熟練操作人員、復(fù)雜操作步驟等，驗(yàn)證試劑方法具有操作簡便、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，且驗(yàn)證試劑對(duì)血清與血漿的檢測(cè)能力具有一致性。

綜上所述，HBV基因分型檢測(cè)(免疫熒光法)試劑盒能滿足國內(nèi)醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床HBV基因分型的檢測(cè)需求，便于及時(shí)報(bào)告結(jié)果，輔助臨床診斷，尤其可在基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)普及使用。

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