針刺對(duì)缺氧缺血性腦病新生小鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響

肖愛嬌,歐陽昕,陳明人

缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)是新生兒時(shí)期較為常見的疾病之一,是指各種圍生期窒息引起的部分或完全缺氧、腦血流減少或暫停而導(dǎo)致胎兒或新生兒腦損傷[1]。新生兒HIE具有較高的致死率和致殘率[2-3],對(duì)該病的研究已引起了廣泛的關(guān)注。近年來臨床研究報(bào)道顯示,針刺治療HIE及其后遺癥日漸增多,并證實(shí)其有效性[4-5],然而有關(guān)針刺治療急性期HIE的報(bào)道很少,其治療急性期HIE的作用機(jī)理研究也并不多見。有研究表明,細(xì)胞凋亡參與了新生鼠缺氧缺血性腦損傷的發(fā)病過程[6-7],而caspase-3被認(rèn)為與細(xì)胞凋亡關(guān)系最為密切,是細(xì)胞凋亡過程的主要執(zhí)行者。

本課題組前期研究觀察到,造模后3 d HIE新生小鼠腦組織中細(xì)胞凋亡數(shù)和caspase-3表達(dá)增加[8-11]。那么,針刺治療能否通過降低腦組織中caspase-3表達(dá)、減少細(xì)胞凋亡而減輕急性期缺氧缺血性腦損傷?為此,本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,采用7 d 新生小鼠制備HIE模型,觀察針刺治療急性期缺氧缺血性腦損傷的效果及對(duì)腦組織細(xì)胞凋亡和caspase-3表達(dá)的影響,以探討針刺的作用機(jī)理,為促進(jìn)針刺在急性期HIE臨床防治中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù),現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選用7 d ICR新生小鼠129只,雌雄不限,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(許可證號(hào) SCXK湘2013-0004)。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和針刺組。假手術(shù)組只行頸部正中切口手術(shù),分離但并不閉合頸總動(dòng)脈,不缺氧;模型組結(jié)扎并剪斷左側(cè)頸總動(dòng)脈,然后給予缺氧處理;針刺組同模型組,于缺氧后進(jìn)行針刺治療,每日1次,每次20 min。各組由于術(shù)中出血、缺氧、母鼠咬死及病情進(jìn)展等原因,死亡 47只,死亡率為36.4%。剩下的82只小鼠中,模型組34只,針刺組29只,假手術(shù)組19只。

1.2 主要試劑和儀器

TTC試劑(2,3,5-氯化三苯基四氮唑,Sigma);一抗,兔抗小鼠 caspase-3(#9664,Cell Signaling Techno- logy);二抗,山羊抗兔(A11011,Invitrogen);熒光封片劑(P36931,Invitrogen),含 DAPI(4'-6'diamino- 2-phenylindole,4',6-二脒基-2-苯基吲哚);凋亡原位檢測(cè)試劑盒(S7165,Millipore)。頭戴式手術(shù)顯微鏡(DL-SSJ,中國(guó) DL公司);熒光顯微鏡及圖像分析軟件(Leica 2000,Leica)。

1.3 HIE新生小鼠模型制備

參照文獻(xiàn)[8-11]制備HIE新生鼠模型,動(dòng)物在異氟烷吸入麻醉狀態(tài)下行頸部正中切口,分離、閉合左側(cè)頸總動(dòng)脈,縫合傷口;術(shù)后動(dòng)物在室溫中恢復(fù)和母乳喂養(yǎng) 2 h后,進(jìn)行缺氧處理,即將動(dòng)物置于 37℃密閉艙,通入氮?dú)?N2),調(diào)節(jié)氧氣濃度為8%,100 min后取出。

1.4 針刺治療方法

取督脈上大椎穴作為治療穴位。大椎穴的定位參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[12]中鼠針灸腧穴定位方法,位于第7頸椎與第1胸椎棘突間,背部正中。在腦缺氧缺血后當(dāng)日,采用蘇州醫(yī)療用品廠有限公司出品的0.30 mm×13 mm無菌針灸針進(jìn)行斜刺,留針20 min,每日1次。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 腦組織梗死檢查

于造模后1 d,給予動(dòng)物異氟醚吸入麻醉后迅速取腦,以 1.5 mm左右間隔自額向枕切成 4個(gè)冠狀切片,加入1%TTC染液,置于37℃溫箱中染色20 min,用掃描儀進(jìn)行掃描,運(yùn)用Image J軟件(national institute of health, USA)測(cè)量每張腦片的梗死面積,并計(jì)算梗死面積百分比[8-11]。梗死面積(%)＝[健側(cè)半球面積－(患側(cè)半球面積－梗死面積)]/全腦面積×100%。

1.5.2 腦組織形態(tài)學(xué)觀察

于造模后7 d,給予動(dòng)物異氟醚吸入麻醉后迅速取腦,用數(shù)碼相機(jī)拍照,然后切片(厚 30 μm),DAPI染色后封片,采用顯微鏡觀察拍照。

1.5.3 腦組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用TUNEL法檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡。于造模后3 d,給予動(dòng)物異氟烷吸入麻醉后迅速取腦,置于 4%多聚甲醛溶液中固定。細(xì)胞凋亡檢測(cè)參見相關(guān)文獻(xiàn)[8-11]進(jìn)行操作。圖中紅色為TUNEL染色陽性細(xì)胞,用Image J軟件進(jìn)行圖像分析,計(jì)數(shù)每個(gè)200倍視野下的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。

1.5.4 腦組織caspase-3陽性細(xì)胞檢測(cè)

采用熒光免疫組織化學(xué)法進(jìn)行測(cè)定。于造模后3 d,給予動(dòng)物異氟烷吸入麻醉后迅速取腦,置于 4%多聚甲醛溶液中固定。腦組織caspase-3陽性細(xì)胞檢測(cè)參照相關(guān)文獻(xiàn)[8-11]進(jìn)行操作。圖中有caspase-3蛋白的部位呈現(xiàn)紅色,用 Image J軟件進(jìn)行圖像分析,計(jì)數(shù)每個(gè)200倍視野下的caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間采用方差分析,組間多重性比較采用Dunnett’s test。

2 結(jié)果

2.1 針刺對(duì)HIE模型小鼠腦梗死面積的影響

由圖 1可見,假手術(shù)組小鼠可見腦組織全部染成紅色,未見梗死灶;模型組小鼠可見右側(cè)半球呈紅色,左側(cè)半球有白色梗死灶;針刺組小鼠可見右側(cè)半球呈紅色;左側(cè)半球有白色梗死灶。經(jīng)測(cè)量分析,模型組腦組織梗死面積百分率與假手術(shù)組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);針刺組腦組織梗死面積百分率與模型組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。詳見表1。

表1 各組腦組織梗死面積百分率比較 (x±s,%)

2.2 針刺對(duì)HIE模型小鼠腦組織形態(tài)的影響

由圖2可見,假手術(shù)組(n=6)腦大體形態(tài)可見腦組織紅潤(rùn),腦溝及腦回清晰,左右兩半球基本對(duì)稱;模型組(n=7)可見左側(cè)腦組織萎縮、塌陷;針刺組(n=9)可見左側(cè)腦組織小面積梗死灶,腦溝變淺。

由圖3可見,假手術(shù)組(n=6)DAPI染色結(jié)果可見腦組織細(xì)胞排列整齊、致密;模型組(n=7)可見患側(cè)腦組織細(xì)胞排列紊亂、疏松,有大量細(xì)胞脫落,細(xì)胞間隙變大;針刺組(n=9)可見患側(cè)腦組織排列較整齊、致密,有少量細(xì)胞脫落。

2.3 針刺對(duì)HIE模型小鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響

模型組小鼠左側(cè)腦組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于假手術(shù)組,兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);而針刺組小鼠左側(cè)腦組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于模型組,兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。詳見表2、圖4。

表2 各組腦組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)比較 (x±s,個(gè))

2.4 針刺對(duì)HIE模型小鼠腦組織caspase-3表達(dá)的影響

模型組小鼠左側(cè)腦組織caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于假手術(shù)組,兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);而針刺組小鼠左側(cè)腦組織caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于模型組,兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。詳見表3、圖5。

表3 各組腦組織caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)比較 (x±s,個(gè))

圖1 各組小鼠腦組織TTC染色結(jié)果

圖2 各組小鼠腦大體形態(tài)

圖3 各組小鼠腦組織DAPI染色結(jié)果(×50 μm)

圖4 各組小鼠腦組織細(xì)胞凋亡結(jié)果(×50 μm)

圖5 各組小鼠腦組織caspase-3表達(dá)結(jié)果(×20 μm)

3 討論

新生兒缺氧缺血性腦病是指由圍生期窒息引起的足月兒和近足月兒(胎齡≥34周)的缺氧缺血性腦損傷(HIBD)。HIE是導(dǎo)致新生兒死亡和不可逆性腦損傷的主要原因,重者可遺留腦性癱瘓、癲癇等難治性兒童腦病,輕者也可能是導(dǎo)致患者今后學(xué)習(xí)障礙、輕癱、細(xì)微運(yùn)動(dòng)問題、注意力缺陷等危險(xiǎn)性升高的原因。因而對(duì)該病的研究引起了廣泛的關(guān)注。

針刺療法作為中醫(yī)學(xué)的獨(dú)特分支,具有安全有效、無不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn),在成人腦梗死治療中越來越受到人們的重視。大量的臨床試驗(yàn)研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,針刺對(duì)梗死腦組織具有多水平、多通道、多靶點(diǎn)的保護(hù)和干預(yù)作用。近年來臨床研究報(bào)道顯示,針刺治療新生兒HIE及其后遺癥日漸增多,并證實(shí)其有效性[4-5]。動(dòng)物研究觀察到針刺具有減輕新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的作用[13]。然而關(guān)于針刺治療急性期新生小鼠HIE的報(bào)道并不多見。本研究采用7 d新生小鼠制備HIE模型,觀察到造模 24 h內(nèi)針刺大椎穴可縮小HIE模型小鼠腦梗死面積,減少腦組織細(xì)胞脫落,表明針刺具有減輕新生小鼠缺氧缺血性腦損傷的作用。然而其作用機(jī)理尚不十分清楚。

新生兒HIE的病理機(jī)制很多,涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、興奮性毒性和細(xì)胞凋亡等。其中,細(xì)胞凋亡在缺血性腦損傷中的作用十分重要[6-7,14-15],且在未成熟腦中比成年腦中更常見[7]。細(xì)胞凋亡是 1972年由 Kerr和 Curry提出的,是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下,遵循自身的程序由基因調(diào)控的主動(dòng)性死亡過程,其發(fā)生、發(fā)展都受到精確的調(diào)控,具有獨(dú)特的信號(hào)通路。目前研究表明,細(xì)胞凋亡通路主要有 caspase依賴性凋亡通路——內(nèi)源性線粒體通路和外源性死亡受體通路以及非caspase依賴性凋亡通路。線粒體通路又稱為內(nèi)源性凋亡途徑,由于線粒體被認(rèn)為處于哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡調(diào)控的中心位置,因此對(duì)該通路的研究一直占有重要地位。線粒體凋亡通路的主要過程是,當(dāng)細(xì)胞受損后,細(xì)胞色素 C(Cyt-C)從線粒體釋放,與細(xì)胞凋亡激活因子1(Apaf-1)結(jié)合活化caspase-9前體,從而激活caspase-3,引發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。死亡受體通路又稱為外源性凋亡途徑,該途徑的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要包括Fas、TNFR1、DR4/DR5和 DR3,雖然這些通路的啟動(dòng)、傳導(dǎo)與調(diào)控各不相同,但也并非完全獨(dú)立,最后都通過各自渠道激活caspase引發(fā)細(xì)胞凋亡。非caspase依賴性通路,其機(jī)制是一個(gè)繁雜的過程,其中以多聚 ADP核糖聚合酶(PARP-1),凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)介導(dǎo)的凋亡通路研究較多。PARP-1是一種DNA修復(fù)酶,在DNA片段化時(shí)被激活,參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)。AIF是一種存在于線粒體膜間隙的黃素蛋白,當(dāng)?shù)蛲鲂盘?hào)刺激時(shí),AIF從線粒體釋放到細(xì)胞漿,再通過核定位信號(hào)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,引起染色質(zhì)濃縮和大片段DNA斷裂[16],造成細(xì)胞凋亡。由于細(xì)胞凋亡過程中染色體DNA的斷裂是一個(gè)漸進(jìn)的分階段的過程,染色體 DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50～300 kb的大片段,然后在Ca2+和Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下,形成180～200 bp核小體DNA多聚體。因此,大量的DNA雙鏈斷裂被認(rèn)為是凋亡最顯著的特征。TUNEL法(即脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法)是將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶等形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’-OH末端,從而進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)。該檢測(cè)方法靈敏度高、反應(yīng)快,能檢測(cè)出極少量的細(xì)胞凋亡,因而被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞凋亡和神經(jīng)元退化的檢測(cè),也被認(rèn)為是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)[17]。為此本研究采用 TUNEL法檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡,結(jié)果觀察到HIE模型組小鼠腦組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多;而與HIE模型組相比,針刺組小鼠腦組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少(見圖 4),表明腦缺氧缺血后發(fā)生了細(xì)胞凋亡,與文獻(xiàn)[8-11]報(bào)道結(jié)果相近;而針刺具有抑制細(xì)胞凋亡的作用,這一結(jié)果與文獻(xiàn)[13,18]報(bào)道基本一致。但是對(duì)于針刺通過哪條凋亡信號(hào)通路起作用還不清楚。

Caspase蛋白是一組天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶,而 caspase-3是溝通內(nèi)源性通路和外源性通路的交匯點(diǎn),被認(rèn)為與凋亡關(guān)系最為密切,在細(xì)胞凋亡中的作用也備受關(guān)注。有研究指出,caspase-3在細(xì)胞凋亡中起著重要的調(diào)控作用,是細(xì)胞凋亡過程中的主要執(zhí)行者,它可水解多種蛋白底物,包括細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、DNA修復(fù)調(diào)節(jié)因子以及細(xì)胞存活等環(huán)節(jié)中重要的蛋白,導(dǎo)致細(xì)胞失去正常功能而凋亡[19]。由此推測(cè),降低 caspase-3的表達(dá)或抑制caspase-3的活性可抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。陳明明等[13]觀察到朱璉針刺興奮法通過降低caspase-3蛋白表達(dá),從而減輕缺氧缺血性腦損傷。范春玲等[20]觀察到頭針透刺腦出血大鼠,可抑制腦部血腫周圍的caspase-3的活化,從而使caspase-3參與誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡減輕,神經(jīng)細(xì)胞得到保護(hù)。本研究結(jié)果顯示,針刺大椎后小鼠腦組織中 caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少(見圖 5),這一結(jié)果與文獻(xiàn)[13,20-21]報(bào)道基本一致,表明針刺可能抑制 caspase-3表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述,針刺減輕急性期缺氧缺血性腦損傷的作用,可能通過其抑制腦組織 caspase-3的表達(dá)及減少腦組織細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的,這為促進(jìn)針刺在防治急性期新生兒HIE的臨床實(shí)踐提供了科學(xué)依據(jù)。然而關(guān)于針刺究竟通過調(diào)控內(nèi)源性信號(hào)通路還是外源性信號(hào)通路繼而抑制細(xì)胞凋亡還有待于將來進(jìn)一步的研究。

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