蘆丁與奧司他韋聯(lián)合對(duì)H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制作用

王心佳,于 淼,李源博,王 燁,于大海,毛春玲，全吉淑*,房學(xué)迅*

(1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué),吉林 延吉133002；2.吉林大學(xué)分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長(zhǎng)春130023;3.吉林亞泰(集團(tuán))有限公司藥物研究與開發(fā)中心,吉林 長(zhǎng)春130000；4.長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院)

流行性感冒是由流感病毒所引起的一種急性呼吸道傳染病。流感在傳播過程中具有致病性強(qiáng)、潛伏期短、致死率高等特點(diǎn),這些特點(diǎn)都對(duì)人類的健康構(gòu)成巨大的威脅[1]。流感病毒是一種單股負(fù)鏈的RNA病毒,屬于正黏病毒科,流感病毒屬[2]。在流感病毒的表面分布著兩種糖蛋白,分別是：HA(血凝素)和NA(神經(jīng)氨酸酶)。其中,NA在流感病毒對(duì)宿主細(xì)胞的侵染過程和子代病毒的釋放過程都起著關(guān)鍵的作用[3-6]。其原理為：流感病毒表面的HA可與宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體以糖苷鍵的方式結(jié)合在一起,NA的作用表現(xiàn)為可切斷二者的連接,由此,流感病毒可脫離宿主細(xì)胞從而重新侵染其它宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制,達(dá)到流感病毒繼續(xù)傳播的作用。所以,以NA為靶點(diǎn)的抗流感病毒藥物已經(jīng)成為全球?qū)W者研究的重點(diǎn)。

中藥在我國(guó)有幾千年的歷史,我國(guó)在治療流感方面積累了大量的理論和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)：連翹、金銀花、炙甘草、穿心蓮等數(shù)十種中藥對(duì)流感病毒都有一定的抑制作用[7]。研究表明,許多從中藥中分離出的中藥單體對(duì)NA具有抑制作用,包括揮發(fā)油類、芪類、生物堿類、黃酮類、多糖類和萜類化合物。其中黃酮類化合物對(duì)神經(jīng)氨酸酶普遍具有抑制作用[7]。蘆丁是植物界分布較廣的一種黃酮類化合物,臨床上主要用于脆性增加的毛細(xì)血管出血癥。王艷芳等[8]研究表明蘆丁對(duì)流感病毒感染導(dǎo)致的小鼠肺部病變具有保護(hù)作用。丁玥等[9]研究結(jié)果表明,蘆丁僅在流感病毒感染后給藥后表現(xiàn)出抗流感病毒活性,說明蘆丁可能作用于流感病毒的釋放和擴(kuò)散階段。

目前,對(duì)流感進(jìn)行治療的藥物主要是奧司他韋。但在治療過程中發(fā)現(xiàn),許多類型的流感病毒對(duì)奧司他韋都具有一定的抗藥性[10]。有臨床實(shí)驗(yàn)表明早期適當(dāng)隔離措施和中西醫(yī)結(jié)合救治,大多數(shù)患者可以康復(fù),中西醫(yī)結(jié)合治療療效快,效果好,并且可以降低耐藥性的出現(xiàn)[11]。李效全等運(yùn)用利巴韋林聯(lián)合雙黃連口服液抗病毒治療輕型甲型H1N1流感取得了良好的效果[12]。也有研究發(fā)現(xiàn),兩種或多種NA抑制劑類藥物與奧司他韋聯(lián)合使用可以明顯降低流感病毒對(duì)奧司他韋的抗藥性,并可以增加在同等劑量下奧司他韋對(duì)NA的抑制率[13,14]。

本文主要研究了中藥單體NA抑制劑蘆丁與奧司他韋聯(lián)合使用對(duì)H1N1型流感病毒神經(jīng)氨酸酶NA(N1)活性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

公司儀器美國(guó)Bio-TekFLX800熒光酶標(biāo)儀芬蘭Finnpipette雷勃微量移液器上海信誼微量振蕩器日本SANYO超低溫冰箱

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與材料

蘆丁(20 mg)單體化合物購(gòu)買自上海源葉生物科技有限公司,將購(gòu)買的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品用 DMSO稀釋至濃度為20 mM,存放于1.5 ml離心管并置于4℃冰箱內(nèi)保存。

NA底物MU-NANA(Cas:M8639)和MES均購(gòu)買自Sigma公司。

達(dá)菲(奧司他韋)購(gòu)買自大連博格林生物科技有限公司。

重組甲型流感病毒 H1N1 神經(jīng)氨酸酶 (A/New Caledonia/20/1999 (H1N1))購(gòu)買于北京義翹神州公司。

1.3 常用溶液配制方法

MES緩沖溶液：用100 ml去離子水將CaCl20.044 g,MES 0.64 g溶解,并調(diào)節(jié)pH值至6.5,即可配制出32.5 mM含有4 mM CaCl2的緩沖溶液,將其放置在4℃冰箱中留存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1蘆丁與奧司他韋對(duì)H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸酶IC50的測(cè)定

首先我們加入體積分別為40 μl的N1和10 μl的蘆丁,使蘆丁在其混合液中的終濃度分別為0 μM,50 μM,100 μM,150 μM,200 μM。在37℃下孵育30 min,然后加入體積濃度各為50 μl 20 μM NA的特異性底物MU-NANA,使反應(yīng)終體積為100 μl,每個(gè)蘆丁濃度重復(fù)4次。最后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)熒光強(qiáng)度,激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為450 nm,檢測(cè)8 min。取4次測(cè)定熒光強(qiáng)度平均值,繪制成橫坐標(biāo)為抑制劑濃度,縱坐標(biāo)為平均反應(yīng)速率的擬合曲線,我們根據(jù)擬合曲線的擬合方程計(jì)算出抑制劑對(duì)H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸酶IC50值。(IC50值：當(dāng)酶活性抑制百分?jǐn)?shù)等于50時(shí),此時(shí)抑制劑的濃度為此抑制劑對(duì)此種酶的IC50)。相同原理,我們加入體積為1 μl其分別為 0 nM,0.5 nM,0.75 nM,1 nM,1.25 nM,1.5 nM,1.75 nM,2 nM濃度的奧司他韋,同樣方法計(jì)算出IC50。

1.4.2蘆丁對(duì)H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制類型的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)研究中使用雙倒數(shù)作圖方式測(cè)定蘆丁對(duì)N1抑制類型。我們?cè)诿笜?biāo)板中的每孔加入10 μl濃度為0.02U N1以及40 μl分別為0,50,100,150,200 μM濃度的蘆丁,輕微震蕩后在37℃下孵育30 min,每個(gè)濃度重復(fù)4次。接著每孔加入50 μl神經(jīng)氨酸酶特異性底物,即MU-NANA,其底物濃度分別為0.5,1,1.5,2 nmol。最后使用酶標(biāo)儀測(cè)定其各自的熒光值,激發(fā)波長(zhǎng)360 nm,發(fā)射波長(zhǎng)450 nm,共計(jì)測(cè)定8 min,記錄結(jié)果并取平均值。根據(jù)結(jié)果使用雙倒數(shù)作圖方式,即橫坐標(biāo)為蘆丁濃度倒數(shù),縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度的倒數(shù),以此進(jìn)行分析蘆丁對(duì)N1的抑制類型。

1.4.3蘆丁與奧司他韋聯(lián)合對(duì)H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制效果測(cè)定

為了測(cè)定蘆丁與奧司他韋聯(lián)合使用對(duì)N1的抑制活性,我們測(cè)定了蘆丁與奧司他韋的聯(lián)合指數(shù)CI(combination index)(CI值可以將兩種或多種藥物混合后的效果進(jìn)行定量的分析)。CI的計(jì)算公式如下公式：

實(shí)驗(yàn)中我們添加體積為10 μl分別為 0.5倍,1倍,2倍,4倍IC50濃度的蘆丁與之對(duì)應(yīng)同倍數(shù)IC50濃度的奧司他韋聯(lián)合,一并與體積為30 μl H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸酶混合,然后在37℃下孵育30 min,最后每孔加入50 μl 神經(jīng)氨酸酶特異性底物MU-NANA(反應(yīng)終體系為100 μl)檢測(cè)N1的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次,取平均值。

表1 CI值與化合物相互作用的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 蘆丁與奧司他韋對(duì)H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制活性

我們配制分別為50,100,150和200 μM濃度的蘆丁與0.5,0.75,1,1.25,1.5,1.75,2 nM濃度的奧司他韋,根據(jù)結(jié)果分別計(jì)算其對(duì)N1抑制活性(IC50),見表2。

表2 蘆丁和奧司他韋對(duì)H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制的IC50值

2.2 蘆丁對(duì)H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸的抑制類型

為了探究蘆丁對(duì)N1的抑制類型,我們分別用不同濃度的蘆丁,即0,50,100,150,200 μM蘆丁與N1作用,再分別用不同濃度底物,即濃度分別為0.5,1,1.5,2 nmol的MU-NANA,以此測(cè)定N1的反應(yīng)速率,得到相對(duì)應(yīng)的熒光值。通過不同的蘆丁濃度與反應(yīng)速率的雙倒數(shù)曲線判斷蘆丁對(duì)N1的抑制類型。如圖1所示,橫坐標(biāo)為抑制劑蘆丁濃度倒數(shù),縱坐標(biāo)為反應(yīng)速率倒數(shù),曲線相交于X軸負(fù)軸上,此結(jié)果說明蘆丁對(duì)N1是非競(jìng)爭(zhēng)抑制,即抑制劑蘆丁結(jié)合在N1的非催化位點(diǎn)區(qū)域。

圖1 蘆丁對(duì)N1抑制類型的測(cè)定

2.3 蘆丁與奧司他韋在體外聯(lián)合使用對(duì)H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸酶的作用

為檢測(cè)蘆丁與奧司他韋聯(lián)合使用對(duì)NA的抑制活性,我們測(cè)定了不同濃度下的蘆丁與奧司他韋的聯(lián)合指數(shù)。根據(jù)蘆丁與奧司他韋對(duì)N1 IC50,確定蘆丁與奧司他韋的聯(lián)合濃度分別為各自0.25,0.5,1,2和4倍的IC50濃度。如圖2(A)所示,X軸表示奧司他韋濃度,Y軸表示聯(lián)合用藥對(duì)N1的抑制速率,兩條曲線分別表示蘆丁與奧司他韋聯(lián)合曲線和奧司他韋單獨(dú)作用于N1的曲線,可以得出,蘆丁與奧司他韋聯(lián)合使用抑制率強(qiáng)于單獨(dú)使用奧司他韋對(duì)N1抑制率；如圖2(B)X軸表示蘆丁濃度,Y軸表示奧司他韋濃度,通過圖中曲線我們得出蘆丁與奧司他韋聯(lián)合對(duì)N1是協(xié)同抑制的作用效果。聯(lián)合指數(shù)CI值如表3所示,在測(cè)試濃度下均小于1,同樣表示出蘆丁與奧司他韋聯(lián)合使用對(duì)H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸酶是協(xié)同的抑制作用效果。

圖2 蘆丁和奧司他韋聯(lián)合使用對(duì)NA的抑制活性

表3 蘆丁和奧司他韋聯(lián)合使用對(duì)N1的CI

3 討論

神經(jīng)氨酸酶是流感病毒的一種重要膜蛋白,在流感病毒對(duì)宿主的早期侵染定位和子代病毒的釋放過程中都起著關(guān)鍵的作用。因此,對(duì)于NA抑制劑的研究成為研究抗流感藥物的熱點(diǎn)[15]。

達(dá)菲是目前為止治療流感病毒最有效的藥物,但是隨著其廣泛的使用,抗藥性流感病毒已經(jīng)出現(xiàn)的越來越頻繁。在H1N1中的H275Y是奧司他韋的抵抗型病毒,對(duì)奧司他韋的敏感性有了些許程度的降低[16]。并且達(dá)菲的使用過程中發(fā)現(xiàn),對(duì)兒童的治療可能導(dǎo)致其死亡[17]。而在實(shí)際治療過程中發(fā)現(xiàn),一些復(fù)方藥物或者聯(lián)合使用的藥物,可以明顯增強(qiáng)藥物的治療效果,或者降低達(dá)菲的使用量減少達(dá)菲對(duì)人體的損傷。葛資宇等[18]研究發(fā)現(xiàn)麻杏石甘湯與奧司他韋聯(lián)合用藥對(duì)A型流感病毒感染小鼠有保護(hù)作用,能抑制流感病毒感染所致的體重下降,降低肺指數(shù),減輕肺組織病理?yè)p傷,效果優(yōu)于麻杏石甘湯組,聯(lián)合用藥組能提高脾指數(shù)、胸腺指數(shù),效果優(yōu)于奧司他韋組。李健猴等[19]研究表明黃芩苷與帕拉米韋聯(lián)合抗流感作用比單獨(dú)使用效果好,在臨床上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

本課題組的研究驗(yàn)證了蘆丁是對(duì)N1具有抑制活性的單體。本課題組通過生物信息學(xué)的方式,利用計(jì)算機(jī)分子模擬對(duì)接方法發(fā)現(xiàn)：配體結(jié)構(gòu)蘆丁還可成功對(duì)接在受體H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸酶生物大分子的非活性區(qū)域,類屬非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。酶學(xué)實(shí)驗(yàn)與生物信息學(xué)方式都驗(yàn)證了蘆丁對(duì)N1是非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。奧司他韋對(duì)N1是競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用[20]。二者分別結(jié)合在N1的不同位點(diǎn),從而為蘆丁與奧司他韋聯(lián)合對(duì)N1抑制作用的探究奠定了基礎(chǔ)。

我們對(duì)蘆丁與奧司他韋進(jìn)行了聯(lián)合指數(shù)的測(cè)定,以此來確定兩種藥物的聯(lián)合使用能否促進(jìn)奧司他韋對(duì)N1抑制活性。首先找出N1的最適濃度,即N1濃度與活性成線性關(guān)系時(shí)其N1的最大濃度。我們測(cè)得其最適濃度為0.02U。隨后,我們又測(cè)定了蘆丁和奧司他韋對(duì)N1的IC50。然后,我們根據(jù)測(cè)定的蘆丁與奧司他韋對(duì)N1的IC50,確定了聯(lián)合使用時(shí)蘆丁與奧司他韋的濃度。最后,我們根據(jù)聯(lián)合使用對(duì)N1抑制的結(jié)果計(jì)算CI值,發(fā)現(xiàn)蘆丁與奧司他韋聯(lián)合使用表現(xiàn)出對(duì)N1協(xié)同抑制的作用效果。

蘆丁類屬維生素類藥,可使毛細(xì)血管通透性和脆性減弱,同時(shí)可保持及恢復(fù)毛細(xì)血管的正常彈性。在防治高血壓腦溢血,糖尿病視網(wǎng)膜出血和出血性紫癜等用途中較高,也用作食品抗氧劑和色素?？稍谑|香葉、煙葉、棗、杏、橙皮、番茄、蕎麥花等植物中發(fā)現(xiàn)蘆丁。我們的研究表明,蘆丁在抗流感方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

藥物的聯(lián)合使用不僅僅是能夠降低對(duì)于患病者的使用量,而且在對(duì)于對(duì)某種特異性抑制的藥物來說,與不同藥物的聯(lián)合使用也能使其達(dá)到很好的治療效果。本研究為我們以后在臨床中治療流感提供了實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。

作者簡(jiǎn)介：王心佳,女,碩士在讀,研究方向：天然分子生物活性研究;全吉淑,女,博士生導(dǎo)師、教授,研究方向：天然分子生物活性研究;房學(xué)迅,男,博士生導(dǎo)師、教授,研究方向：基質(zhì)金屬蛋白酶的生物功能、酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)與生物活性。

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