延髓頭端腹外側(cè)區(qū)谷氨酸和門冬氨酸在前庭性血壓調(diào)控中的作用

周 冰，詹麗潔，楊賀旻，南 軍，蘭 艷*

(1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院 麻醉專業(yè)2014級，吉林 延吉133002;2.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室·長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室，吉林 延吉133002；3.延邊大學(xué) 細(xì)胞功能研究中心，吉林 延吉133002;4.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 骨科，吉林 延吉133000)

血壓穩(wěn)定性的維持是包括壓力感受性反射和前庭交感反射在內(nèi)的復(fù)雜的神經(jīng)調(diào)節(jié)過程[1]。當(dāng)機體血壓增高時，位于頸動脈竇和主動脈弓的壓力感受器的傳入沖動增加，經(jīng)孤束核(NTS)將神經(jīng)沖動傳遞到延髓頭端腹外側(cè)區(qū)(RVLM)，使交感神經(jīng)的緊張性活動抑制。同時又經(jīng)迷走神經(jīng)背核和疑核，使心迷走神經(jīng)的緊張性活動增加，從而維持血壓穩(wěn)定[2]。

當(dāng)姿勢改變時，前庭感受器興奮，來自前庭的傳入信號可引起心血管系統(tǒng)功能的改變[3]。來自耳石和半規(guī)管的傳入信號可以通過前庭神經(jīng)內(nèi)側(cè)核和前庭神經(jīng)下核經(jīng)NTS傳遞至RVLM。而NTS也可以接受來自心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和肺的初級傳入，是調(diào)節(jié)中樞交感舒血管反射的關(guān)鍵腦區(qū)[4]。RVLM在交感緊張性調(diào)節(jié)和血壓的調(diào)控中起關(guān)鍵作用，將來自其他中樞和外周的傳入信息整合后傳到脊髓中間外側(cè)柱的交感節(jié)前神經(jīng)元，最終完成對心血管活動的調(diào)節(jié)[5]。本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)[6-8]，硝普鈉(SNP)誘發(fā)的急性低血壓可使外周前庭器官破壞和去竇弓大鼠RVLM和NTS中c-Fos和pERK蛋白的表達(dá)明顯減少。這些結(jié)果提示，外周前庭感受器和壓力感受器共同參與急性低血壓時血壓穩(wěn)定性的維持。

RVLM存在多種氨基酸類遞質(zhì)及其相應(yīng)的受體，它們在RVLM對心血管活動的調(diào)節(jié)中具有重要的作用。有報道指出[9]，RVLM給予外源性的興奮性氨基酸，如門冬氨酸(ASP)、谷氨酸(Glu)會出現(xiàn)血壓升高的現(xiàn)象。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)[10,11]，SNP誘發(fā)的急性低血壓可使VN興奮性氨基酸Glu、ASP水平增高，這種增高效應(yīng)可被外周前庭器官破壞所阻斷。這一結(jié)果表明，SNP誘發(fā)的急性低血壓通過外周前庭器官興奮VN，興奮性氨基酸Glu和ASP可能參與其中。而RVLM 中興奮性氨基酸含量變化在前庭器官所介導(dǎo)的前庭性血壓調(diào)控中作用的研究，還未見報道。

本研究在麻醉大鼠，利用核團(tuán)微量透析、高效液相分析等方法和技術(shù)，探討破壞外周前庭器官或去除壓力感受器后，誘發(fā)急性低血壓時前庭系統(tǒng)通過RVLM參與血壓調(diào)節(jié)時Glu和ASP含量的變化，以進(jìn)一步說明外周前庭器官-前庭神經(jīng)核-RVLM的前庭性心血管調(diào)控的中樞通路存在的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

實驗選用雄性、體重220-250g，清潔級SD大鼠40只，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實驗動物科提供[許可證號碼：SCXK(吉)-2011-0004]。實驗動物被隨機分為4組，即，假手術(shù)組(sham group)、雙側(cè)迷路破壞組(BL)、 壓力感受器去除(SAD) 組及雙側(cè)迷路和壓力感受器破壞組(SAD+BL)。每組10只。

1.2 雙側(cè)迷路破壞

取實驗組大鼠用10%水合氯醛，按300 mg/kg的劑量經(jīng)腹腔注射麻醉，將對氨基苯胂酸鹽溶液(0.1 ml)分別經(jīng)兩側(cè)外耳道穿透鼓膜注入中耳內(nèi)，隨即放入棉球填塞外耳道。BL組及BL+SAD組在模型制備48 h后用于實驗，Sham組、SAD組大鼠中耳內(nèi)注射等量生理鹽水。

1.3 壓力感受器去除

大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉后， 仰臥放置于手術(shù)臺上，在頸部分離雙側(cè)主動脈神經(jīng)，用眼科剪將其剪斷。小心剝離頸動脈竇區(qū)，用10%的苯酚溶液在局部涂擦，清除竇神經(jīng)。SAD模型制備24 h后用于實驗，Sham組、BL組施行同樣手術(shù)，但只暴露不分離與切斷神經(jīng)。

1.4 微量透析探針樣本的收集及部分氨基酸含量的測定

將大鼠腹腔注射烏拉坦(500 mg/kg)麻醉，頭部固定于立體腦定位儀上。參照Paxinos和Waston的大鼠腦圖譜[12]，將透析探針插入到RVLM區(qū)(坐標(biāo)：耳棒連線后2.8-3.6mm，正中線旁開1.2-2.0 mm，腹側(cè)腦表面下0.8-1.0 mm)。 定位結(jié)束后，將透析探針連接到微量灌流泵(ESP-64，日本Eicom公司)，并用人工腦脊液以1.5 μl/min速度對大鼠RVLM區(qū)進(jìn)行灌流，先穩(wěn)定90 min后，再收集灌流液樣本，每管樣本收集10 min，每管樣本量為15 μl，收集結(jié)束后貯存于-80℃冰箱中保存，待氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)分析時取出。

將收集好的樣本每12 μl加入4 mmol/L的OPA溶液3 μl在室溫下反應(yīng)2.5 min后，抽取反應(yīng)液10 μl(其中樣本占8 μl)，經(jīng)進(jìn)樣器推入到微量分析系統(tǒng)，測定樣本中氨基酸的含量。

1.5 組織學(xué)鑒定

透析實驗結(jié)束后，將動物處死，取腦固定，3天后取出， 20%蔗糖脫水，24 h后行冰凍切片，自然干燥后進(jìn)行中性紅染色，在顯微鏡下查看透析探針?biāo)诘奈恢谩τ谔结槢]有插入RVLM區(qū)的大鼠所有實驗數(shù)據(jù)均不納入統(tǒng)計范圍。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，以mean±SEM 表示。以給SNP前3個樣本中Glu和ASP含量的平均值作為100%，通過計算測得每例樣本中兩種氨基酸含量與基礎(chǔ)值的百分比。統(tǒng)計學(xué)處理采用方差分析，P<0.05定為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 BL和SAD 對大鼠行為學(xué)的影響

大鼠雙側(cè)迷路破壞后，主要表現(xiàn)為行為慌張、站立不穩(wěn)等體征。壓力感受器去除大鼠活動減少，攝食、攝水減少。為此，實驗中采取了術(shù)后精心護(hù)理、單籠飼養(yǎng)和嚴(yán)格控制麻醉藥劑量的方法來減少大鼠死亡率。

2.2 靜脈注入SNP對大鼠平均動脈壓的影響

基礎(chǔ)狀態(tài)下Sham組、BL組、SAD組和SAD+BL組的平均動脈壓分別為105.30±3.75，98.87±5.77，104.04±2.26和103.90±3.93 mmHg，各組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05,表1)。當(dāng)靜脈注入SNP(15 μg/kg/min，3 min)時，各組大鼠的平均動脈壓(MAP)在1 min內(nèi)明顯降低，并在隨后給藥的2 min內(nèi)持續(xù)維持低壓狀態(tài)，灌注結(jié)束后血壓恢復(fù)正常。靜脈注入SNP引起各組大鼠血壓分別降低到70.87 ± 3.50，63.51±2.61，69.05±3.81和65.81±2.83 mmHg，與給藥前相比有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,表1)。

表1 靜脈注射SNP對MAP的影響(n=10)

2.3 SNP誘發(fā)的急性低血壓對RVLM區(qū)ASP和Glu含量的影響

表2顯示了4個實驗組RVLM區(qū)興奮性氨基酸ASP和Glu含量的基礎(chǔ)值，各組中含量無顯著性差異(P>0.05)。

表2 RVLM區(qū)ASP和Glu含量的基礎(chǔ)值(pmol/8 μl，n=10)

實驗中發(fā)現(xiàn)，靜脈注入SNP10 min后ASP和Glu含量開始增加，Sham組ASP的含量增加到給藥前的(165.48±10.78)%(P<0.05,圖1)，隨后ASP含量逐漸降低，在給藥50 min時恢復(fù)到基礎(chǔ)值狀態(tài)。BL組和SAD組ASP含量也在給藥10 min時分別增加至(134.97±11.41)%和(119.51±9.65)%(P<0.05,圖1)。但ASP含量在SAD+BL組與給藥前相比無明顯變化(P>0.05,圖1)。同時，樣本中Glu含量在Sham組、BL組和SAD組也分別增高為注入SNP前的(207.45±22.56)%、(178.44±28.47)%和(121.59±12.94)%，與基礎(chǔ)值相比均有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05,圖2)。Glu含量在給藥40 min時基本恢復(fù)到給藥前水平。SAD+BL組的Glu含量在注射SNP前后無明顯變化(P>0.05,圖2)。

組間比較顯示，與假手術(shù)組相比，BL組和SAD組在誘發(fā)急性低血壓后ASP和Glu升高的程度明顯減少(P<0.05)；與BL組相比，SAD組在誘發(fā)急性低血壓ASP和Glu含量的變化明顯減少(P<0.05)；而SAD+BL組與SAD組比較兩種氨基酸的含量無明顯變化(P>0.05,圖1，圖2)。

↑：infusion of SNP.*P<0.05 vs.基礎(chǔ)狀態(tài);#P <0.05 vs.Sham組;△P<0.05 vs.BL組

↑：infusion of SNP.*P<0.05 vs.基礎(chǔ)狀態(tài);#P<0.05 vs.Sham組;△P<0.05 vs.BL組

3 討論

在當(dāng)前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)：①靜脈注入SNP降低Sham組、BL組、SAD組和SAD+BL組平均動脈壓，灌注結(jié)束后血壓恢復(fù)正常。②4個實驗組基礎(chǔ)狀態(tài)下RVLM區(qū)Glu和ASP的含量無變化。③SNP引起的急性低血壓在給藥10 min時Glu和ASP的含量變化達(dá)最大值，與Sham組相比，BL組、SAD組和SAD+BL組Glu和ASP含量明顯降低。

前庭系統(tǒng)通過交感神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)血壓。然而，雙側(cè)迷路損傷的患者伴有直立性低血壓，而且BL動物由平臥位轉(zhuǎn)為直立體位時血壓也下降[13]。這些研究說明，前庭系統(tǒng)在體位變化時血壓穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)中起重要作用。血壓下降會引起外周血管痙攣，這是一種由交感神經(jīng)介導(dǎo)的壓力感受性反射，因此可以使迷路缺血，引起眩暈等直立性低血壓的癥狀[14]。前庭交感反射可以預(yù)防姿勢改變時由于交感神經(jīng)系統(tǒng)激活而引起的直立不耐受。盡管壓力感受器和前庭感受對血壓變化敏感，但前庭感受器主要對低血壓比較敏感，而壓力感受性反射在高血壓和低血壓的時候都參與血壓的調(diào)節(jié)[15]。而且，我們前期研究也發(fā)現(xiàn)[6,7]，靜脈注射SNP所誘發(fā)的急性低血壓使前庭神經(jīng)內(nèi)側(cè)核和RVLM區(qū)c-Fos和pERK蛋白表達(dá)增加，但是這些現(xiàn)象可被BL、SAD、SAD+BL所阻斷。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，外周前庭器官感受器對血壓下降有反應(yīng)。

Glu和ASP是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的興奮性氨基酸。RVLM是中樞交感輸出的最后共同通路，RVLM前交感神經(jīng)元的基礎(chǔ)活動在維持基礎(chǔ)血壓、交感神經(jīng)活動緊張性和壓力反射功能等心血管活動的整合中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[5]。本實驗中，SNP誘發(fā)的急性低血壓會使Sham組大鼠RVLM區(qū)細(xì)胞外液中興奮性氨基酸ASP和Glu明顯增多， BL組和SAD組在誘發(fā)急性低血壓后Glu和ASP也表現(xiàn)出相似的變化，但增加幅度較Sham組明顯減少。這一結(jié)果與我們之前報道的c-Fos和pERK蛋白在各實驗組中的變化一致。盡管低血壓，尤其是姿勢運動時壓力感受器對RVLM區(qū)Glu的釋放中所起的作用比前庭感受器重要。但是，急性低血壓時RVLM區(qū)中Glu和ASP釋放增加與前庭感受器有關(guān)已經(jīng)得到公認(rèn)。當(dāng)發(fā)生低血壓、姿勢改變時可以激活前庭感受器，姿勢改變引起的直立性低血壓與前庭系統(tǒng)有關(guān)。

綜上所述，SNP引起的急性低血壓可引起RVLM區(qū)Glu和ASP的釋放增加。盡管壓力感受器的傳入在急性低血壓時RVLM區(qū)興奮性遞質(zhì)Glu和ASP的釋放中起主要作用，但是前庭傳入在維持血壓，尤其是姿勢改變時血壓的維持同樣也起重要作用。但是在RVLM區(qū)除興奮性氨基酸外，還存在抑制性氨基酸，這些抑制性氨基酸在前庭性血壓調(diào)控中的作用還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Guyenet PG.The sympathetic control of blood pressure[J].Nat Rev Neurosci,2006,7:335.

[2]Pilowsky PM,Goodchild AK.Baroreceptor reflex pathways and neurotransmitters:10 years on[J].J Hypertens,2002,20:1675.

[3]Normand H,Etard O,Denise P.Otolithic and tonic neck receptors control of limb blood flow in humans[J].J Appl Physiol (1985),1997,82:1734.

[4]Kalia M,Mesulam MM.Brain stem projections of sensory and motor components of the vagus complex in the cat:II.Laryngeal,tracheobronchial,pulmonary,cardiac,and gastrointestinal branches[J].J Comp Neurol,1980,193:467.

[5]Sugiyama Y,Suzuki T,Yates BJ.Role of the rostral ventrolateral medulla (RVLM) in the patterning of vestibular system influences on sympathetic nervous system outflow to the upper and lower body[J].Exp Brain Res,2011,210(3-4):515.

[6]Yan Lan,Huan-jun Lu,Xian Jiang,et al.Analysis of the baroreceptor and vestibular receptor inputs in the rostral ventrolateral medulla following hypotension in conscious rats[J].Korean J Physiol Pharmacol,2015,19(2):159.

[7]Xian Jiang,Li-wei Li,Yan Lan,et al.Comparative analysis of vestibular receptor and baroreceptor inputs to the nucleus tractus solitarius following acute hypotension in conscious rats[J].Neuroscience Letters,2014,563,70.

[8]蘭 艷，姜 憲，楊彥召，等.破壞前庭器官對壓力感受性反射敏感性的影響[J].中國實驗診斷學(xué),2013,17(3):421.

[9]Amano M,Asari T,Kubo O.Excitatory amino acid receptors in the rostral ventrolateral medulla mediate hypertension induced by carotid body chemoreceptor stimulation[J].Naunyn Schemiedebergs Arch Phannacol,1994,349:549.

[10]Xiang-Lan Li,Ying An,Qing-Hua Jin,et al.Changes of some amino acid concentrations in the medial vestibular nucleus of conscious rats following acute hypotension[J].Neuroscience Letters,2010,477:11.

[11]Xiang-Lan Li,Bin Nian,Yan Jin,et al.Mechanism of glutamate receptor for excitation of media vestibular nucleus induced by acute hypotension[J].Brain Research,2012,1443:27.

[12]Paxinos G,Waston C.The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates[M].Academic Press:New York,1982.

[13]Aoki M,Sakaida Y,Tanaka K,et al.Evidence for vestibular dysfunction in orthostatic hypotension[J].Exp Brain Res,2012,217:251.

[14]Pirodda A,Brandolini C,Carlo Modugno G.Hypotension associated with autonomic dysfunction:a possible cause of vertigo?[J]．Med Hypotheses,2004,63:1086.

[15]Lan Y,Yang YZ,Jiang X,et al.Additive role of the vestibular end organ and baroreceptors on the regulation of blood pressure in rats[J].Korean J Physiol Pharmacol,2013,17:367.