脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮對(duì)癌細(xì)胞的促增殖和促遷移作用

邱思奇 徐貞貞 沈 紅 陳愛亮 楊曙明 晁雨竹

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

霉菌毒素(mycotoxins)是由鐮刀菌屬(Fusarium)、曲霉菌屬(Aspergillus)和青霉菌屬(Penicillium)等真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1-2]，常見且對(duì)畜牧業(yè)危害較大的霉菌毒素包括黃曲霉毒素(aflatoxins,AFs)、單端孢霉烯族毒素[trichothecenes，如T-2毒素和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)]、玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)及煙曲霉毒素等[3]。霉菌毒素廣泛存在于食品和飼料中，是全球畜牧業(yè)生產(chǎn)、畜產(chǎn)品質(zhì)量安全及食品安全所面臨的一個(gè)重要問題[4]。Iqbal等[5]對(duì)115份雞肉和80份雞蛋樣品中AFs、OTA和ZEN進(jìn)行檢測(cè)，分別從35%雞肉和28%雞蛋中檢出了AFs，從41%雞肉和35%雞蛋中檢出了OTA，從52%雞肉和32%雞蛋中檢出了ZEN。龔阿瓊等[6]對(duì)2015年國內(nèi)市場(chǎng)上65份玉米樣品中黃曲霉毒B1(aflatoxin B1,AFB1)、ZEN和DON進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)南方區(qū)域3種霉菌毒素的檢出率均在90%以上。杜妮[7]的研究表明，飼糧和原料中多種霉菌毒素共存現(xiàn)象很普遍，高達(dá)96.48%的飼糧和原料受到2種及以上霉菌毒素污染。人類和動(dòng)物長期暴露于霉菌毒素會(huì)對(duì)健康造成嚴(yán)重的影響，如誘發(fā)癌癥、引發(fā)腎毒性和造成免疫抑制等[8]。目前，大量利用細(xì)胞模型對(duì)霉菌毒素毒性進(jìn)行研究的文獻(xiàn)表明，霉菌毒素會(huì)抑制細(xì)胞增殖、具有細(xì)胞毒性甚至誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等[9-11]。

根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(international agency for research on cancer,IARC)對(duì)致癌物的分類，AFB1被列為1類致癌物，黃曲霉毒M1(aflatoxin M1,AFM1)和OTA被列為2B類，而ZEN和DON則被列為3類，即致癌作用尚不清楚。我國現(xiàn)行《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)》GB 2761—2011規(guī)定了食品中AFB1、AFM1、DON、展青霉素(patulin,PAT)、OTA及ZEN 6種毒素的限量指標(biāo)，其中谷物及其制品中ZEN的殘留限量為60 μg/kg，高于除DON(殘留限量為1 000 μg/kg)以外的其他4種毒素。近年來，有學(xué)者報(bào)道較低劑量的霉菌毒素有促進(jìn)癌細(xì)胞增殖的作用，如T-2毒素(<0.009 6 nmol/L)和OTA(<0.003 2 nmol/L)能顯著促進(jìn)Myc基因轉(zhuǎn)染的人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5 Myc)增殖[12]。有關(guān)霉菌毒素，特別是ZEN和DON的致癌特性尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲是研究腫瘤惡性程度的重要指標(biāo)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)是癌細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵事件[13]。何穎等[14]在干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白(IBP)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT發(fā)生的研究中，主要觀察了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移情況。Abassi等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，ZEN對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞有促增殖和促遷移作用，表明ZEN具有潛在致癌性。因此本研究擬利用人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞(HCT116細(xì)胞)、人肺癌細(xì)胞(A549細(xì)胞)、人肝癌細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)這3種癌細(xì)胞模型，以O(shè)TA為陽性對(duì)照組，研究ZEN和DON對(duì)癌細(xì)胞的促增殖和促遷移作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

HCT116、A549、HepG2細(xì)胞系購自國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心(http://www.crcpumc.com)。

OTA、ZEN、DON、噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)均購自美國Sigma-Aldrich公司。OTA、ZEN、DON均用甲醇溶解成貯存液(20 mmol/L)于-20 ℃儲(chǔ)存，使用時(shí)再用培養(yǎng)基稀釋為工作濃度。IMDM培養(yǎng)基、McCoy’s 5A培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺(200 mmol/L)、青霉素(100 IU/mL)-鏈霉素(100 μg/mL)雙抗均購自美國Gibco公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HCT116、A549和HepG2細(xì)胞分別用IMDM培養(yǎng)基、McCoy’s 5A培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、含5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱(美國Nuaire公司)內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)基均含有10% FBS、1%L-谷氨酰胺、1%青霉素-鏈霉素雙抗。

1.2.2 細(xì)胞活力測(cè)定

分別取處于對(duì)數(shù)生長期的HCT116、A549和HepG2細(xì)胞，用0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)溶液消化后，加入相應(yīng)的完全培養(yǎng)基以終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/mL，以100 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，于37 ℃、5%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。霉菌毒素濃度設(shè)置參考文獻(xiàn)[15-16]，試驗(yàn)組分別加入100 μL含不同濃度(0.016、0.080、0.400、2.000、10.000、50.000 μmol/L)霉菌毒素(OTA、ZEN、DON)的完全培養(yǎng)基，空白對(duì)照組霉菌毒素濃度為0 μmol/L(每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次)，繼續(xù)孵育24 h。棄培養(yǎng)基，每孔加入0.5 mg/mL MTT溶液100 μL，于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，每孔加100 μL DMSO，振蕩10 min，用Sunrise酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)測(cè)492 nm波長處吸光度(A492)值。按公式計(jì)算細(xì)胞活力：

細(xì)胞活力(%)=(試驗(yàn)組A492值/
空白對(duì)照組A492值)×100。

1.2.3 細(xì)胞遷移能力測(cè)定

取處于對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，用0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液消化后，分別加入相應(yīng)的完全培養(yǎng)基以終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105個(gè)/mL，以2 mL/孔接種于背面做好標(biāo)記的培養(yǎng)皿(直徑為35 mm)中，于37 ℃、含5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育24 h。用10 μL槍頭垂直于底面的橫線制造劃痕，吸棄上清，加入1 mL 磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞3次，洗去劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片。試驗(yàn)組分別加入1、10、100 nmol/L OTA、DON和ZEN，空白對(duì)照組只加培養(yǎng)基(每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次)，在顯微鏡下拍照。根據(jù)收集的圖片數(shù)據(jù)分析試驗(yàn)結(jié)果，按公式計(jì)算細(xì)胞劃痕愈合率：

細(xì)胞劃痕愈合率(%)=[(T0時(shí)劃痕寬度值-
Tt時(shí)劃痕寬度值)/T0時(shí)劃痕寬度值]×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著時(shí)進(jìn)行LSD各組間多重比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉菌毒素種類和濃度對(duì)細(xì)胞活力的影響

2.1.1 3種霉菌毒素對(duì)HCT116細(xì)胞活力的影響

3種霉菌毒素對(duì)HCT116細(xì)胞活力的影響見圖1。不同濃度的OTA對(duì)HCT116細(xì)胞活力的影響有差異，與空白對(duì)照組相比，OTA在濃度較低(0.080、0.400 μmol/L)時(shí)能顯著或極顯著增強(qiáng)HCT116細(xì)胞活力(P<0.05或P<0.01)，表現(xiàn)出明顯的促增殖作用；而OTA在濃度較高(10.000、50.000 μmol/L)時(shí)能極顯著降低HCT116細(xì)胞活力(P<0.01)，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。10.000 μmol/L OTA使HCT116細(xì)胞活力降低為空白對(duì)照組的83.78%，50.000 μmol/L使HCT116細(xì)胞活力降低為空白對(duì)照組的75.06%。與空白對(duì)照組相比，DON在中高濃度(≥0.400 μmol/L)時(shí)能極顯著降低HCT116細(xì)胞活力(P<0.01)，ZEN只在濃度為0.400和50.000 μmol/L時(shí)能極顯著降低HCT116細(xì)胞活力(P<0.01)。其中，0.400 μmol/L DON和ZEN分別使HCT116細(xì)胞活力降低為空白對(duì)照組的80.56%和85.22%。由此可見，低濃度(0.016、0.080 μmol/L)DON和ZEN對(duì)HCT116細(xì)胞不具有與OTA相似的促增殖作用。

A：OTA，B：DON，C：ZEN。*表示與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，* *表示與空白對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。圖2、圖3、圖4同。

A: OTA, B: DON, C: ZEN. * indicated significant difference compared with the blank control group (P<0.05), and * * indicated significant difference compared with the blank control group (P<0.01). The same as Fig.2, Fig.3 and Fig.4.

圖13種霉菌毒素對(duì)HCT116細(xì)胞活力的影響

Fig.1 Effects of three kinds of mycotoxins on cell viability of HCT116

2.1.2 3種霉菌毒素對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

3種霉菌毒素對(duì)A549細(xì)胞活力的影響見圖2。與空白對(duì)照組相比，OTA在中低濃度(≤2.000 μmol/L)時(shí)能顯著或極顯著增強(qiáng)A549細(xì)胞活力(P<0.05或P<0.01)，表現(xiàn)出明顯的促增殖作用；OTA在濃度較高(10.000、50.000 μmol/L)時(shí)則能極顯著降低A549細(xì)胞活力(P<0.01)，10.000 μmol/L OTA使A549細(xì)胞活力降低為空白對(duì)照組的79.81%，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。與空白對(duì)照組相比，DON在中高濃度(2.000、10.000、50.000 μmol/L)時(shí)能極顯著降低A549細(xì)胞活力(P<0.01)，其中，2.000 μmol/L DON使A549細(xì)胞活力降低為空白對(duì)照組的69.59%。與空白對(duì)照組相比，ZEN只在濃度為50.000 μmol/L時(shí)能極顯著降低A549細(xì)胞活力(P<0.01)，降低為空白對(duì)照組的73.25%。由此可見，OTA、DON和ZEN 3種霉菌毒素對(duì)A549有細(xì)胞毒性的最小濃度分別10.000、2.000、50.000 μmol/L，則3者毒性強(qiáng)弱順序?yàn)椋篋ON>OTA>ZEN。在A549細(xì)胞上，低濃度的OTA表現(xiàn)出促增殖作用，而濃度的DON和ZEN則無明顯促增殖作用。

圖2 3種霉菌毒素對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

2.1.3 3種霉菌毒素對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響

3種霉菌毒素對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響見圖3。與空白對(duì)照組相比，OTA、DON、ZEN在濃度較低(0.016、0.080 μmol/L)時(shí)均能極顯著增強(qiáng)HepG2細(xì)胞活力(P<0.01)，表現(xiàn)出明顯的促增殖作用。與空白對(duì)照組相比，DON在中高濃度(≥2.000 μmol/L)時(shí)能極顯著降低HepG2細(xì)胞活力(P<0.01)，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，OTA在濃度為50.000 μmol/L時(shí)才能極顯著降低HepG2細(xì)胞

活力(P<0.01)，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，即DON毒性強(qiáng)于OTA。與空白對(duì)照組相比，ZEN濃度在0.016～50.000 μmol/L時(shí)均能顯著或極顯著的增強(qiáng)HepG2細(xì)胞活力(P<0.05或P<0.01)，表現(xiàn)出明顯的促增殖作用。由此可見，3種霉菌毒素對(duì)HepG2細(xì)胞毒性由強(qiáng)到弱依次為DON、OTA、ZEN，而低濃度的DON和ZEN具有與OTA相似的促增殖作用。

圖3 3種霉菌毒素對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響

2.2 霉菌毒素對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響

采用細(xì)胞劃痕愈合試驗(yàn)評(píng)價(jià)1～100 nmol/L的OTA、DON、ZEN對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果見圖4、圖5。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，1、10 nmol/L OTA作用13、24、48 h后能極顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞遷移(P<0.01)，100nmol/LOTA作用24、48 h能極顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞遷移(P<0.01)；1、10 nmol/L DON和ZEN作用24、48 h能極顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞遷移(P<0.01)，且均在1 nmol/L處理48 h時(shí)促進(jìn)HepG2細(xì)胞遷移的效果最明顯。

圖4 OTA、DON和ZEN分別處理HepG2細(xì)胞3、13、24、48 h的遷移率測(cè)定

圖5 OTA、DON和ZEN分別對(duì)HepG2細(xì)胞劃痕愈合的影響

3 討 論

霉菌毒素具有腎毒性[9]、肝毒性[11,16]、免疫毒性[17]，并有致畸、致突變和致癌[18-19]等危害，其中一部分研究通過建立細(xì)胞模型，在細(xì)胞水平上研究霉菌毒素的毒性及其毒性機(jī)理。霉菌毒素的濃度在研究其對(duì)細(xì)胞的毒性及機(jī)理中存在不可忽視的影響。大多研究表明，霉菌毒素濃度相對(duì)較高時(shí)具有明顯的細(xì)胞毒性。OTA濃度為15 μmol/L時(shí)能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡[20]，OTA濃度高于15 μmol/L對(duì)人淋巴細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒性[21]。Abassi等[12]的研究中，高濃度OTA對(duì)野生型人結(jié)直腸癌細(xì)胞(HCT116 WT)、FLIP蛋白過表達(dá)的人結(jié)直腸癌細(xì)胞(HCT116 FLIP)和MRC-5 Myc細(xì)胞均有明顯的細(xì)胞毒性，其半抑制濃度(IC50)分別為170、120、20 μmol/L。Dai等[22]的研究表明，DON在100～1 600 ng/mL的濃度內(nèi)對(duì)小鼠腸上皮細(xì)胞(ESCs)的毒性隨毒素劑量的增加或作用時(shí)間的延長而增強(qiáng)。ZEN濃度超過5 μmol/L時(shí)，能顯著降低小鼠睪丸間質(zhì)瘤細(xì)胞(MLTC-1)的活力[23]。50 μmol/L ZEN對(duì)張氏肝細(xì)胞(CCL 13)無明顯的毒性作用，而100 μmol/L ZEN能顯著降低CCL 13細(xì)胞活力。本研究首先采用MTT法檢測(cè)OTA、DON和ZEN分別對(duì)HCT116、A549、HepG2細(xì)胞活力，結(jié)果表明OTA(>10.000 μmol/L)和ZEN(50.000 μmol/L)均能極顯著降低HCT116、A549細(xì)胞活力，具有明顯細(xì)胞毒性；同時(shí)DON(>2.000 μmol/L)對(duì)HCT116、A549和HepG2這3種細(xì)胞均有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，且毒性呈劑量依賴性。

此外，目前人們?cè)谘芯棵咕舅貙?duì)細(xì)胞毒性作用時(shí)，其考察的低濃度霉菌毒素一般無細(xì)胞毒性，如Kang等[16]的研究表明，高濃度ZEN(100 μmol/L)能顯著降低CCL 13細(xì)胞活力，而低濃度ZEN(50 μmol/L)無明顯的毒性作用。但也有報(bào)道表明低濃度的ZEN(1～1 000 nmol/L)促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖，可能具有致癌性[15]。本研究對(duì)低濃度霉菌毒素的促增殖作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明IARC確定的2B類致癌物OTA在低濃度范圍內(nèi)(<0.400 μmol/L)對(duì)3種癌細(xì)胞都有促增殖作用，而DON(≤2.000 μmol/L)和ZEN(≤50.000 μmol/L)對(duì)HCT116、A549細(xì)胞無促進(jìn)增殖作用，但對(duì)于HepG2細(xì)胞有顯著的促增殖作用，0.016 μmol/L的DON和ZEN分別使HepG2細(xì)胞活力比空白對(duì)照組增長了26.2%和33.8%，均高于OTA的21.3%。

細(xì)胞遷移參與多種生理活動(dòng)，如胚胎發(fā)育、傷口愈合、組織再生等，同時(shí)，也是某些疾病發(fā)生的基本過程，如腫瘤的形成，在腫瘤發(fā)生過程中，細(xì)胞遷移起著核心作用，它是細(xì)胞擴(kuò)散并侵襲組織的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[24]。Abassi等[15]研究表明，ZEN能促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116遷移，其可能具有致癌性。本研究進(jìn)一步采用細(xì)胞劃痕愈合試驗(yàn)分別研究了DON和ZEN對(duì)HCT116、A549和HepG2細(xì)胞遷移能力的影響，以O(shè)TA作為陽性對(duì)照，結(jié)果顯示，1 nmol/L DON作用于HepG2細(xì)胞48 h促遷移作用與10 nmol/L OTA相似，ZEN促遷移作用稍弱。

后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步完善試驗(yàn)?zāi)Ｐ停ㄟ^多種毒理學(xué)機(jī)理研究手段，全面評(píng)估DON和ZEN在低濃度下可能存在的致癌性，為相關(guān)霉菌毒素的毒理學(xué)研究提供細(xì)胞水平試驗(yàn)支撐。進(jìn)一步研究上述2種霉菌毒素的毒性機(jī)理，更全面地了解其毒性特別是致癌性，對(duì)于預(yù)測(cè)和預(yù)防霉菌毒素對(duì)人體和動(dòng)物健康的有害影響意義重大。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，陽性對(duì)照OTA在3種細(xì)胞體系內(nèi)，均表現(xiàn)出促進(jìn)癌細(xì)胞增殖的作用，而DON和ZEN僅對(duì)HepG2細(xì)胞有顯著的促增殖作用，同時(shí)DON和ZEN在HepG2細(xì)胞上表現(xiàn)出與OTA相似的促細(xì)胞遷移的作用，這表明DON和ZEN在HepG2細(xì)胞系上具有潛在的致癌性。

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