甲狀腺惡性潛能未定的高分化腫瘤差異表達蛋白的蛋白質組學分析

唐銘 楊慧 劉鵬杰 徐敏潔 張迎紅 陳天星

[摘要] 目的 篩選與鑒定甲狀腺惡性潛能未定的高分化腫瘤（WT-UMP）差異表達蛋白質分子，尋找新的蛋白質標志物。 方法 收集2015年1月～2016年12月云南省第一人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）手術切除新鮮標本甲狀腺WT-UMP 20例及其周圍正常甲狀腺組織20例，另收集2016年1～12月我院病理科甲狀腺乳頭狀癌（PTC）蠟塊30例。從冰凍新鮮樣本中分別提取總蛋白進行雙向凝膠電泳（2-DE），經(jīng)PDQuest 7.3圖像分析軟件檢測表達差異點，利用基質輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）和SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫對差異蛋白進行鑒定，通過PANTHER分析對差異蛋白進行分類，選擇其中5種差異表達蛋白通過免疫組織化學染色進行驗證。 結果 共鑒定出27種差異蛋白，在甲狀腺WT-UMP中呈高表達的25個，呈低表達的2個。免疫組化染色顯示5種蛋白Cytosolic non-specific dipeptidase（CNDP2）、Cytokeratin18（CK18）、Cathepsin B（CTSB）、Calreticulin（CRT）及Annexin A5（ANXA5）均定位于細胞漿。CK18、CTSB、CRT及ANXA5這4種蛋白的表達在WT-UMP中均高于正常甲狀腺，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），在PTC中均高于WT-UMP，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。 結論 成功篩選了甲狀腺WT-UMP差異表達蛋白質分子，這些蛋白質表達的改變，可能參與了WT-UMP的發(fā)生和發(fā)展。同時通過免疫組化的驗證，有利于WT-UMP的早期診斷。

[關鍵詞] 甲狀腺惡性潛能未定的高分化腫瘤；差異表達蛋白；蛋白質組學；蛋白質標志物

[中圖分類號] R365 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）03（a）-0060-06

[Abstract] Objective To identify the differential expression proteins in thyroid well-differentiated tumour of uncertain malignant potential （WT-UMP） and to look for new protein biomarkers. Methods A total of 20 thyroid WT-UMP resection samples and 20 normal thyroid tissues adjacent to thyroid WT-UMP were obtained from January 2015 to December 2016 in the First People's Hospital of Yunnan Province （hereinafter referred to as "our hospital"）. In addition， 30 blocks papillary thyroid carcinoma （PTC） were obtained from the pathology department of our hospital from January to December 2016. The total proteins which were extracted from frozen thyroid samples in each group were profiled with two-dimensional electrophoresis （2-DE）. The differential protein spots were identified by PDQuest 7.3 software and identified by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-fight mass spectrometry （MALDI-TOF-MS） and SWISS-PROT database. The different proteins were classified by PANTHER analysis and five differentially expressed proteins of these spots were further validated through immunohistochemistry （IHC）. Results 27 proteins were identified with MS. There were 25 high expression and 2 low level expression proteins in thyroid WT-UMP. IHC revealed the following five proteins located in the cytoplasm： cytosolic non-specific dipeptidase （CNDP2）， cytokeratin 18 （CK18）， cathepsin B （CTSB）， calreticulin （CRT） and annexin A5 （ANXA5）. Four kinds of proteins include CK18， CTSB， CRT and ANXA5 were over-expressed in thyroid WT-UMP compared with normal tissues， the difference was statistically significant （P < 0.05）； Meanwhile， the four proteins were over-expressed in PTC compared with thyroid WT-UMP （P < 0.05）. Conclusion The differentially expressed protein molecules were successfully screened and identified in thyroid WT-UMP. The changes of these proteins expression may be involved in the genesis and development of thyroid WT-UMP. The newly identified protein biomarkers can positively contribute to early thyroid WT-UMP diagnosis by using IHC.

[Key words] Thyroid well-differentiated tumour of uncertain malignant potential； Differentially expressed protein； Proteomics； Protein markers

2017年第四版內(nèi)分泌腫瘤WHO分類提出了甲狀腺交界性腫瘤的概念。這類腫瘤具有非常惰性的生物學行為，而且治愈率高，無需追加RAI治療[1]。準確診斷這類腫瘤將減少對患者侵襲性的治療、減輕其心理壓力并降低社會經(jīng)濟負擔。惡性潛能未定的高分化腫瘤（WT-UMP）屬于甲狀腺交界性腫瘤的其中一種類型，是一種全由或部分具有乳頭狀甲狀腺癌核改變和可疑包膜或血管侵犯的、高分化濾泡細胞組成的有包膜或境界清楚的腫瘤。在HE形態(tài)上有時與甲狀腺乳頭狀癌（PTC）難以鑒別。為了更加準確的診斷WT-UMP，本研究采用雙向電泳和質譜技術，通過數(shù)據(jù)庫搜索鑒定WT-UMP的差異表達蛋白，并選取5種蛋白進行免疫組化驗證以期獲得可用于臨床病理診斷的特異蛋白質標志物，對WT-UMP的早期診斷及鑒別診斷提供理論和實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年1月～2016年12月云南省第一人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）手術切除新鮮的甲狀腺標本，其中WT-UMP20例，其周圍正常甲狀腺組織20例。新鮮標本均置于-80℃凍存，用于雙向凝膠電泳（2-DE）檢測。所有標本均經(jīng)石蠟切片進行組織病理學確診。另收集2016年1～12月我院病理科明確診斷的甲狀腺乳頭狀癌蠟塊30例。

WT-UMP診斷標準：參照2017版WHO內(nèi)分泌腫瘤分類。腫瘤邊界清楚，有或無包膜，全部或部分具有毛玻璃樣的核，無明確包膜、血管侵犯，無淋巴結轉移。

正常甲狀腺診斷標準：參照人民衛(wèi)生出版社2013年出版的第8版《組織學與胚胎學》。濾泡由單層濾泡上皮圍繞膠質構成，濾泡上皮細胞因功能狀態(tài)不同呈扁平、立方或柱狀。取材時切取WT-UMP旁3 cm以上甲狀腺組織作為正常的甲狀腺組織。

PTC診斷標準：參照2017版WHO內(nèi)分泌腫瘤分類。腫瘤組織呈分枝乳頭狀，常伴有不規(guī)則的濾泡，具有PTC樣細胞核的特征（細胞核增大、核排列擁擠重疊、核輪廓不規(guī)則、毛玻璃樣核、核溝、核內(nèi)假包涵體等），有包膜或血管的侵犯。

1.2 試劑

動物組織裂解液及PMSF購自上海碧云天生物技術公司；干膠條購自美國Bio-Rad公司；考馬斯亮藍購自美國MP Biomedicals公司；CK18及MaxVision2二抗試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)公司；CTSB、CNDP2及ANXA5購自Abcam；CRT購自R&D; systems。

1.3 方法

1.3.1 蛋白提取 同組樣本等量混合后每組取0.1 g樣本，加液氮研磨成粉，加入1 mL含蛋白酶抑制劑PMSF的裂解液，離心后取上清。加入-20℃冷丙酮，冷卻、離心后取沉淀。適量水化液重溶沉淀，-70℃冰箱保存。經(jīng)Bradford法測蛋白質樣品濃度。

1.3.2 雙向電泳 取500 μg樣品蛋白與水化液混合，加入1 μL IPG Buffer混勻，總體積500 μL，取IPG預制干膠條被動水化上樣12 h。將上好樣的膠條轉移至聚焦盤中進行一向等電聚焦電泳。聚焦完畢后，立即將膠條依次置于含DTT的平衡緩沖液Ⅰ、含IAA的平衡緩沖液Ⅱ中各平衡15 min，然后進行雙向SDS-PAGE電泳，固定后行考馬斯亮藍染色。用Expression 10000 XL掃描凝膠圖像，采用PDQuest 7.3圖像分析軟件在相同參數(shù)設置下，對WT-UMP組和正常甲狀腺組的2-DE圖譜進行差異蛋白分析，將差異倍數(shù)3倍及以上的點定義為差異蛋白差異點。

1.3.3 質譜鑒定 利用基質輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）分析對差異蛋白點進行鑒定，獲取一級和二級肽指紋圖譜，使用GPS Explorer（V3.6）軟件對質譜數(shù)據(jù)分析，然后進行SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫檢索，進一步確定蛋白質。一級質譜和二級質譜綜合可信度達到95%為可信的鑒定結果。

1.3.4 免疫組化染色 20例WT-UMP、20例正常甲狀腺及30例PTC均用MaxVision法進行IHC染色（按說明書進行操作）。結果判讀以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，綜合染色強度及陽性細胞數(shù)量進行半定量分析。染色強度評分：無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽性細胞所占百分比評分：<5%記0分，5%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分。兩項結果相加，總得分：0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～5分為中等陽性（++），6～7分為強陽性（+++）。所有病例的免疫組化結果由兩位高級職稱病理醫(yī)師采用雙盲法進行評估。

1.3.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗，等級資料比較采用秩和檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 雙向電泳

通過2-DE技術得到WT-UMP和正常甲狀腺的2-DE電泳圖譜（圖1）。兩組圖譜相比較，共發(fā)現(xiàn)41個差異蛋白點。其中38個蛋白質表達上調(diào)，3個下調(diào)。

2.2 質譜結果

通過MALDI-TOF-MS分析，41個差異蛋白點均成功獲得一級和二級肽指紋圖譜，CK18一級和二級肽指紋圖譜。見圖2。經(jīng)SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫檢索，去除鑒定結果相同的蛋白點，共鑒定出27種蛋白質。見表1。與正常甲狀腺比較，在WT-UMP中有25個上調(diào)蛋白，2個下調(diào)蛋白（ALB、LMNA）。

2.3 生物信息學分類

根據(jù)PANTHER分類分析及功能注釋，對質譜鑒定出的27種蛋白進行生物信息分析。按分子功能分類，多數(shù)蛋白（43.5%）的分子功能為催化活性，如CNDP2具有金屬蛋白酶活性，這說明WT-UMP的發(fā)生發(fā)展是一種生物變化的過程，需要酶類的參與。其次，22.1%的蛋白具有結構分子活性，可能與細胞外基質、角蛋白、髓鞘、核糖體的構成相關，這類蛋白構成了細胞的基本骨架。其他蛋白具有載體活性（6.4%）、抗氧化活性（3.2%）、連接（14.2%）、酶調(diào)節(jié)活性（6.8%）和受體活性（3.8%）。按生物學途徑分類，31.2%的蛋白參與代謝途徑，其次22.6%蛋白與細胞間聯(lián)系、細胞周期、細胞生長、細胞增殖、細胞識別等細胞過程相關，說明這類蛋白與WT-UMP的發(fā)生、發(fā)展相關，如：ANXA1、CK18、γ-actin等。其他相關生物學途徑還有應答反應（8.5%）、凋亡過程（1.7%）、生物學調(diào)控（4.2%）、細胞組分形態(tài)發(fā)生與組成（12.1%）、發(fā)育過程（11.4%）、免疫系統(tǒng)過程（1.6%）和定位（6.7%）。按細胞組份分類，86.4%的蛋白分布在細胞內(nèi)（包含細胞漿及細胞器），9.1%分布在細胞外區(qū)，4.5%為大分子復合物。

2.4 免疫組化染色結果

本研究選取5種蛋白（CNDP2、CK18、CTSB、CRT及ANXA5）進行免疫組化染色，5種蛋白抗體染色均定位于胞漿，其中CTSB、CRT及ANXA5也在胞膜中表達。結果顯示，CK18、CTSB、CRT及ANXA5這4種蛋白的表達在WT-UMP中均高于正常甲狀腺（P < 0.05），在PTC中均高于WT-UMP（P <0.05 ），CNDP2均無明顯差異。五種蛋白的表達結果見表2。CK18及CRT在三組中的表達見圖3（封三）。

3 討論

蛋白質組（proteome）的概念最早由Marc Wilkins提出，是指由一個基因組或一個細胞、組織表達的所有蛋白質[2]。近20年來，作為一種高通量、高靈敏度的技術，蛋白質組學（proteomics）已被廣泛應用于各種惡性腫瘤的臨床研究。以往對于PTC的發(fā)生、發(fā)展、轉移以及預后的相關蛋白及基因的研究已經(jīng)取得了重大的進展[3-4]，但對于交界性腫瘤的認識及研究均較為匱乏。本研究采用2-DE質譜分析，同時篩選出差異蛋白，并用免疫組化的方法進行驗證，為甲狀腺交界性腫瘤的臨床病理診斷及鑒別診斷提供理論依據(jù)。

質譜共鑒定出27種蛋白質，由于鑒定出的蛋白數(shù)量較多，本實驗挑選出5種相對含量較高且重復性較好的蛋白（CNDP2、CK18、CTSB、CRT及ANXA5）進行免疫組化染色。免疫組化結果顯示：CNDP2在三組中的表達均呈陰性或弱陽性，三組間無統(tǒng)計學差異。CK18、CTSB、CRT在WT-UMP中均以中等至強陽性染色為主，在PTC中均以強陽性染色為主。ANXA5在WT-UMP中呈弱至中等陽性染色，在PTC中呈中等至強陽性染色。CK18、CTSB、CRT及ANXA5在WT-UMP與正常甲狀腺間及WT-UMP與PTC間均存在差異，具有統(tǒng)計學意義。同時，這四種蛋白的染色強度在三組中均呈遞增形勢，說明它們對WT-UMP的發(fā)生發(fā)展起到一定作用，WT-UMP與PTC在蛋白質水平具有正相關性。

CK18分布于上皮細胞，屬于細胞骨架蛋白家族。在臨床病理診斷工作中，CK18是輔助診斷腺上皮、間皮和尿路上皮源性腫瘤的有用指標[5]。有文獻報道，CK18宜作為甲狀腺癌浸潤和轉移的標志物[6]。本研究中，CK18在正常甲狀腺中主要呈陰性或弱陽性表達，在WT-UMP中以中等至強陽性表達為主，與正常甲狀腺比較在各個程度的表達都具有統(tǒng)計學差異，在PTC中以強陽性表達為主，與WT-UMP比較在中等陽性及強陽性表達時具有統(tǒng)計學差異。因此，只有當CK18呈強陽性表達時，對鑒別正常甲狀腺、WT-UMP和PTC之間有較好的應用價值。

組織蛋白酶B（CTSB）是溶酶體內(nèi)半胱氨酸組織蛋白酶，屬于木瓜蛋白酶家族。該酶廣泛參與蛋白質的降解，并與細胞凋亡有著密切的聯(lián)系[7-8]。研究表明CTSB與腫瘤血管生成相關因子MMP-9有明顯關系，在乳腺癌、肺癌、頭頸部癌等多種惡性腫瘤中表達上調(diào)[9-10]。已有文獻分析了PTC和正常甲狀腺組織的蛋白質組學，結果顯示：CTSB在PTC中的表達高于正常甲狀腺[11-12]。本研究中，蛋白質組學及免疫組化染色均顯示CTSB在WT-UMP中的表達高于正常甲狀腺，同時免疫組化結果顯示CTSB在PTC中的表達顯著高于正常甲狀腺及WT-UMP，這與以往研究結果一致。CTSB參與裂解基質、基底膜的過程，促進腫瘤細胞的生成。因此該酶可作為一種可行的標志物用于PTC與WT-UMP的鑒別診斷。

CRT最先由Ostwald和Maclennan于1974年從骨骼肌肌漿網(wǎng)中首次分離獲得，是一種普遍存在且高度保守的內(nèi)質鈣結合蛋白，具有多種生物學功能，包括參與腫瘤抗原提呈、血管的發(fā)生及細胞的凋亡等。CRT表達量的改變可以使細胞的侵襲、黏附、增殖等生物學行為發(fā)生改變，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預后密切相關[13]。近年許多研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤中CRT及其裂解片段有量的改變，如肺癌、肝癌、食管癌、子宮內(nèi)膜樣腺癌等，這些研究均表明CRT有望成為多種腫瘤的新標志物，有利于協(xié)助惡性腫瘤的早期診斷[14]。ANXA5是膜聯(lián)蛋白家族中的一員，其功能主要有作為鈣通道、抗炎抗凝血、促進細胞凋亡等[15]，有報道顯示：ANXA5可促進腫瘤的惡化，其表達上調(diào)與乳腺癌的分期呈正相關[16]。關于CRT及ANXA5這兩種蛋白在甲狀腺腫瘤中表達水平的研究報道不多，也有少許文獻[17-18]對膜聯(lián)蛋白家族其他蛋白在甲狀腺腫瘤中的表達做了研究，結果顯示膜聯(lián)蛋白家族各成員的表達水平不盡相同，ANXA3在PTC中的表達水平低于正常組，然而ANXA4在PTC中的表達水平均高于結節(jié)性甲狀腺腫和癌旁正常甲狀腺組織。本研究的雙向電泳結果顯示，相對于正常甲狀腺，CRT及ANXA5在WT-UMP中的表達量均上升，同時免疫組化結果也驗證了這一結論。因此，從這兩種蛋白的功能聯(lián)系本研究結果，CRT及ANXA5可能與WT-UMP的發(fā)生發(fā)展有關，可作為PTC與WT-UMP鑒別診斷有用的蛋白標志物應用于臨床病理診斷。

CNDP2是雙肽金屬蛋白酶，是M20家族成員，具有肌肽酶的活性。CNDP2在不同的腫瘤中具有表達差異性。例如在乳腺癌、腎細胞癌和結直腸癌中，CNDP2均顯著高表達，而在胰腺癌和胃癌中，CNDP2則普遍低表達，甚至可能擔當一個抑癌基因的角色[19-20]。在本研究中，CNDP2在WT-UMP及PTC兩組中的表達以陰性或弱陽性為主，在正常甲狀腺組中80%以上不表達，三組間無統(tǒng)計學意義。但質譜結果顯示，WT-UMP組CNDP2蛋白上調(diào)。實驗結果的不一致可能與樣本量較小有關，因此有待更多的標本量去驗證。

綜上所述，CK18、CTSB、CRT及ANXA5這四種蛋白對WT-UMP的診斷及鑒別診斷均具有一定的臨床應用價值。

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