川芎嗪中間體2-氯甲基-3，5，6三甲基吡嗪的合成優(yōu)化

趙 蕊，張欣鈺，吳高榮，徐 冰，韓耀天，陳 萌，王鵬龍，雷海民

(北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102488)

近年來，川芎成分及其活性研究受到越來越多的關注，而川芎嗪作為川芎的天然活性成分在藥物設計中也得到了廣泛應用[1-9]，通過對川芎嗪衍生物進行結構修飾得到了許多新型結構,有些化合物活性甚至優(yōu)于臨床藥物，如具有顯著抑制血小板聚集作用的創(chuàng)新藥物川阿格雷，其抑制活性強于陽性藥奧扎格雷[10-11]；候選藥物T-VA對CoCl2損傷的PC12細胞具有較強的保護作用[12-13]；對先導化合物T-OA進行體外活性測試，發(fā)現其對肝癌及結腸癌細胞抑制作用與陽性藥順鉑類似[14]。

以上化合物的共同特點在于結構中均引入了川芎嗪小分子，其引入方式普遍采用TMP-Cl或2-溴甲基-3，5，6-三甲基吡嗪(TMP-Br)酯化或成醚。實踐中發(fā)現TMP-Br對口、鼻、眼等器官具有強烈的黏膜刺激性[15]，目前在化合物結構修飾中逐漸放棄使用。研究發(fā)現，TMP-Cl與TMP-Br反應活性相當，且刺激性較弱，易分離得到其單體成分，是目前川芎嗪衍生物合成過程中應用最為廣泛的重要中間體[16-18]。

TMP-Cl的常用合成方法有本實驗首次提出的直接鹵代的“一步法”與氧代、乙?；⑺夂蜏睾望u代的“四步法”[19-20]。目前尚未有文獻對這2種方法進行系統(tǒng)地對比分析。本實驗通過HPLC監(jiān)測反應進程，用HRMS、1H-NMR及13C-NMR分析確認化合物的結構，對2種反應方式進行了對比研究，并在實驗過程中首次提出溫和鹵代的反應條件，較常規(guī)的二氯亞砜鹵代法有較大工藝改進，對TMP-Cl合成方法的優(yōu)化具有實際的參考意義，為川芎嗪衍生物的藥物設計與結構修飾提供新的途徑與方向。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters 2695型UV檢測器(美國沃特世公司)；CD-85WAC型節(jié)能燈(江門市蓬江區(qū)哥迪照明電器廠)；Agilent Techonologies 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS(美國安捷倫科技有限公司)。

1.2試藥 2，3，5，6-四甲基吡嗪(質量分數99.0%，批號77787626,N-氯代琥珀酰亞胺(質量分數98.0%，批號K1527077)，上海邁瑞爾化學技術有限公司；對甲苯磺酰氯(質量分數98.0%，批號10182665，賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；4-二甲基氨基吡啶(質量分數98.0%，批號1224275；Fluka公司)；甲醇(批號170237，Fisher公司)；四氯化碳(體積分數99.5%，批號20170213)，乙酸(體積分數99.5%，批號20160504)，氫氧化鈉(批號20170217)，四氫呋喃(體積分數99.5%，批號 20130712),正己烷(體積分數99.5%，批號20161020)，均購自北京化工廠；10.0 mol·L-1過氧化氫，乙酸酐(體積分數98.5%，批號20130325)，購自國藥集團化學試劑有限公司；三乙胺(體積分數99.0%，批號20150920)，天津市福晨化學試劑廠；實驗用水為去離子水；甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1方法

2.1.1液相色譜條件 色譜柱：Waters XBridge-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(體積比60∶40)；檢測波長：280 nm；流速：1 min·mL-1；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；樣品質量濃度：1 g·L-1。

2.1.2質譜條件 電噴霧離子化源(ESI)：檢測電壓3.5 kV；蒸發(fā)室溫度為300 ℃；流速為10.0 min·L-1；霧化器壓力為30 psi。

2.1.3“一步法”制備TMP-Cl 將研細的N-氯代琥珀酰亞胺(NCS)1.92 g(14.4 mmol)倒入反應瓶中，加入適量CCl4使之分散，攪拌，同時加入研細的川芎嗪2.17 g(16.0 mmol)，室溫無明顯光照條件下充分混合2 h。將反應瓶置于85 ℃油浴中，強光照射，引發(fā)反應，當溶劑上層出現漂浮物且溶液澄清發(fā)黃時，TLC監(jiān)測。待生成物不再增加時停止反應。減壓蒸除CCl4溶液，得到淡黃色液體，(石油醚∶二氯甲烷=5∶1) 分離純化得到無色油狀液體1.04 g，即TMP-Cl，反應途徑見圖1。

圖1“一步法”合成2-氯甲基-3，5，6-三甲基吡嗪

Fig.1 The "one-step method"to synthesize 2-chloromethyl-3，5，6-trimethyl pyrazine

2.1.4“四步法”制備TMP-Cl a.取2.17 g川芎嗪(16.0 mmol)溶于50.0 mL冰乙酸中，加入2.0 mL 10.0 mol·L-1過氧化氫于90 ℃油浴條件下反應4 h，之后補充10.0 mol·L-1過氧化氫2.0 mL繼續(xù)反應4 h，TLC監(jiān)測至反應完全后，冷卻至室溫，以12.5 mol·L-1氫氧化鈉將pH值調至10，二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑，得到白色川芎嗪單氮氧化合物粗品(TMP-O)。b.將該粗品置于反應瓶中，加入1.5 mL (16.0 mmol)乙酸酐，于105 ℃加熱回流2 h，TLC監(jiān)測至反應完全后，減壓蒸除過量的乙酸酐，得到黑色漿狀川芎嗪乙?；?TMP-OAc)。c.將此黑色漿狀物置于10.0 mL (THF∶MeOH∶H2O=3∶1∶1)的溶液，分批加入2.0 g (48.0 mmol)氫氧化鈉，攪拌反應2 h，二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸除溶劑，得到羥基川芎嗪粗品，以正己烷重結晶，得1.85 g黃色針狀結晶(TMP-OH)。d.將此黃色針狀結晶溶于15.0 mL無水四氫呋喃中，然后加入3.3 g (15.9 mmol)TsCl、2.5 g (24.4 mmol)TEA和0.2 g (12.2 mmol) DMAP，攪拌4 h，二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，過濾，回收溶劑，得到淡黃色TMP-Cl粗品，硅膠柱分離(石油醚∶二氯甲烷=5∶1)，得無色油狀的TMP-Cl 1.75 g，反應途徑見圖2。

圖2“四步法”合成2-氯甲基-3，5，6-三甲基吡嗪

試劑及條件：a.乙酸，10.0 mol·L-1過氧化氫，回流，90 ℃，6 h；b.乙酸酐，回流，105 ℃，2 h；c.THF∶MeOH∶H2O=3∶1∶1，氫氧化鈉，1 h；d.THF，TsCl，TEA，DMAP，4 h。

Fig.2 The "four-step method" to synthesize 2-chloromethyl-3，5，6-trimethyl pyrazine

Reagents and conditions:a. AcOH，10.0 mol·L-1H2O2，reflux，90 ℃，6 h；b.Ac2O，reflux，105 ℃，2 h； c.THF∶MeOH∶H2O=3∶1∶1，NaOH，1 h；d.THF，TsCl，TEA，DMAP，4 h.

2.2結果

2.2.1“一步法”反應監(jiān)測結果 取“一步法”反應液少量，處理后進樣，HPLC圖見圖3。由圖3可知，峰1保留時間為5.506 min，結合TLC監(jiān)測，分離純化該反應液，得到純度較高的峰1化合物，反應產率為50%左右。通過質譜對峰1進行結構確認，確定該化合物為TMP-Cl，見圖4。

圖3“一步法”合成2-氯甲基-3，5，6-三甲基吡嗪反應

HPLC圖

Fig.3 HPLC chromatogram of "one-step" synthesis reaction of 2-chloromethyl-3，5，6-trimethyl-pyrazine

圖4峰1化合物結構解析

Fig.4 Structure analysis of compound peak 1

2.2.2“四步法”反應監(jiān)測結果 收集“四步法”的每一步反應液，分別處理進樣，HPLC法觀察其反應情況，通過對各步驟反應液進行監(jiān)測，發(fā)現“四步法”各步反應產率較高，在實際操作過程中，可直接進入下一步反應，減少了分離純化過程中帶來的化合物損失，最終反應產率高達80%。同時對各步反應產物進行質譜分析，確認化合物結構。見圖5至圖6。

圖5各步反應液HPLC圖

A.步驟a反應液；B.步驟b反應液；C.步驟c反應液；D.步驟d反應液。

Fig.5 HPLC chromatogram of each step of reaction liquid

A.step a reaction liquid；B.step b reaction liquid；C.step c reaction liquid；D.step d reaction liquid.

對“一步法”與“四步法”TMP-Cl反應液進行TLC監(jiān)測(二氯甲烷∶甲醇=100∶1)，見圖7。由圖7可知，右側為TMP-Cl對照品，左側為反應液，中間為交叉點；“一步法”TLC監(jiān)測反應產物下方為川芎嗪原料，反應不完全且雜質較多，雜質極性與反應產物相近，較難分離；“四步法”TLC監(jiān)測，原點為催化劑等強極性物質，分離純化時不會對產物造成影響，結果表明，該方法反應較為完全，雜質量少且極性與反應產物相差較大，分離純化簡單易得。

對終產物TMP-Cl通過核磁數據進行結構確認，見圖8，進一步驗證該化合物結構的準確性。

1H-NMR (400 MHz，CDCl3) 4.64(-CH2)，2.58(-CH3)，2.49(-CH3)，2.47(-CH3)。13C-NMR (101 MHz，CDCl3) 152.07，149.59，149.51，146.58，45.23，22.05，21.79，20.99。HRMS：171.068 2 [M+H]+C8H11ClN2m/z170.061 1。

圖6各步反應產物離子流圖及結構解析

A.步驟a反應產物結構解析；B.步驟b反應產物結構解析；C.步驟c反應產物結構解析；D.步驟d反應產物結構解析。

Fig.6 Ion chromatogram and structure analysis of reaction products in each step

A.step a structural analysis of the reaction product；B.step b structural analysis of the reaction product；C.step c structural analysis of the reaction product；D.step d structural analysis of the reaction product.

圖7“一步法”與“四步法”反應TLC圖

Fig.7 TLC monitor of "one-step method" and "four-step method" reaction

圖8TMP-Cl核磁譜圖

A.TMP-Cl核磁氫譜圖；B.TMP-Cl核磁碳譜圖。

Fig.8 NMR spectra of TMP-Cl

A.1H-NMR of TMP-Cl；B.13C-NMR of TMP-Cl.

3 討論

2-氯甲基-3，5，6三甲基吡嗪(TMP-Cl)作為當前設計、合成川芎嗪衍生物的重要中間體受到國內外學者的廣泛關注?！耙徊椒ā迸c“四步法”均能得到純度較高的TMP-Cl?！耙徊椒ā睘楸緦嶒炇状翁岢龅暮铣煞椒?，借鑒TMP-Br的合成方式，將川芎嗪溶于CCl4溶液中，加入引發(fā)劑，通過加熱、光照引發(fā)自由基反應，借助N-氯代琥珀酰亞胺將氯原子引入川芎嗪中。“四步法”在多篇文獻中已有詳細報道，但目前尚未有人對這2種方法進行對比分析，從以下幾個方面來看，“四步法”優(yōu)于“一步法”。首先，從化學反應過程中所需試劑來看，“一步法”使用CCl4，毒性較大，對神經有麻醉作用，對肝、腎有嚴重的損害；“四步法”所用化學試劑毒性均較弱，對化學工作者或生態(tài)環(huán)境的危害均較小。其次，在對反應液進行TLC監(jiān)測時發(fā)現，“一步法”反應產生的雜質極性與產物極性接近，且雜質量大較難分離。“四步法”反應雜質極性與產物極性相差較大，且雜質量較小易于分離。再次，通過液相反應監(jiān)測可知“一步法”反應產率為50%左右，而“四步法”產率高達80%，因此，“四步法”具有較明顯的反應優(yōu)勢。

“四步法”中步驟a～c較為成熟，是2-羥甲基-3，5，6-三甲基吡嗪(TMP-OH)的常規(guī)合成方法，已有多篇文獻對其進行了報道。而步驟d常用方法為二氯亞砜鹵代法，該方法反應較劇烈且試劑較刺激。本實驗首次提出溫和鹵代的方法：將DMAP作為催化劑，促進TsCl與TMP-OH中的羥基形成磺酸酯，脫掉的一分子氯化氫與弱親核試劑TEA產生的“自由”氯負離子從背面進攻碳原子，加速TMP-Cl的生成。這種溫和鹵代的方法具有較高的反應產率，對TMP-Cl合成工藝的優(yōu)化具有非常重要的指導意義。

本實驗后期預通過設計正交實驗，確定“四步法”最佳制備工藝，進一步提高其反應產率。同時探究其他類吡嗪化合物是否具有類似川芎嗪的反應性質，為吡嗪類衍生物在結構修飾中的應用提供實驗方向。

參考文獻：

[1] 姜維，趙美，陳曦，等.HPLC法同時測定大鼠血漿中川芎成分洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸[J].西北藥學雜志，2016，31(5):462-466.

[2] 杜旌暢，謝曉芳，熊亮，等.川芎揮發(fā)油的化學成分與藥理活性研究進展[J].中國中藥雜志，2016，41(23):4328-4333.

[3] Xu B，Chu F，Zhang Y，et al.A series of new ligustrazine-triterpenes derivatives as anti-tumor agents：design，synthesis，and biological evaluation[J].Int J Mol Sci，2015，16(9)：21035-21055.

[4] Zhang C，Yan W，Zhao R，et al.Design，synthesis and evaluation of new ligustrazine derivatives as potential plasma-stable neuroprotective agents[J].Med Chem Comm，2017，8(3)：652-656.

[5] 汪林，王鵬龍，緒擴，等.川芎嗪衍生物構效關系研究進展[J].中草藥，2013，44(19):2766-2771.

[6] 王鵬龍，徐昕，李國梁，等.新型川芎嗪衍生物的合成及其抗癌活性研究[J].西北藥學雜志，2014，29(1):58-64.

[7] 緒擴，王鵬龍，汪林，等.四甲基吡嗪系列衍生物合成中間體的制備工藝研究進展[J].中國新藥雜志，2013，22(9):1038-1041，1055.

[8] 李國梁，王鵬龍，徐昕，等.川芎嗪中間體的合成及其對CoCl2致分化PC12細胞損傷的保護作用[J].中國中藥雜志，2014，39(14):2679-2683.

[9] 張昌林，倪小佳，李春花，等.川芎嗪的結構修飾及生物活性研究進展[J].中藥新藥與臨床藥理，2017，28(4):549-556.

[10]Chen H，Li G，Zhan P，et al.Ligustrazine derivatives.part 5：design，synthesis and biological evaluation of novel ligustrazinyloxy-cinnamic acid derivatives as potent cardiovascular agents[J].Eur J Med Chem，2011，46(11)：5609-5615.

[11]李家明，趙永海，馬逢時，等.川芎嗪芳酸衍生物的合成及抗血小板聚集活性[J].有機化學，2008，28(9):1578-1583.

[12]張晨澤，閆萌萌，徐冰，等.候選藥物T-VA的質譜裂解規(guī)律及其在大鼠體內的代謝產物研究[J].質譜學報，2017，38(1):67-74.

[13]Wang P，Zhang H，Chu F，et al.Synthesis and protective effect of new ligustrazine-benzoic acid derivatives against CoCl2-induced neurotoxicity in differentiated PC12 cells[J].Molecules，2013，18(10):13027-13042.

[14]Xu K，Xu X，Chu F，et al.Synthesis and biological evaluation of T-OA analogues as the cytotoxic agents[J].Res Chem Int，2015，41(9):6257-6269.

[15]楊楚耀，黃新明.2-溴甲基-3，5，6-三甲基吡嗪及其衍生物的制備[J].復旦學報:自然科學版，1980，19(4)：390-394.

[16]Chen H，Li G，Zhan P，et al.Design，synthesis and biological evaluation of novel trimethylpyrazine-2-carbonyloxy-cinnamic acids as potent cardiovascular agents[J].Med Chem Comm，2014，(5):711-718.

[17]Cheng X，Liu X，Xu W，et al.Ligustrazine derivatives.Part 3：design，synthesis and evaluation of novel acylpiperazinyl derivatives as potential cerebrocardiac vascular agents[J].Bioorg Med Chem，2009，17(8)：3018-3024.

[18]Deng L，Guo X，Zhai L，et al.Ligustrazine Derivatives.Part 4:Design，synthesis，and biological evaluation of novel ligustrazine-based stilbenederivatives as potential cardiovascular agents[J].Chem Biol Drug Des，2012，79(5)：731-739.

[19]Xu B，Yan W，Xu X，et al.Combination of amino acid/dipeptide with ligustrazine-betulinic acid as antitumor agents[J].Eur J Med Chem，2017，(130):26-38.

[20]Cheng X，Liu X，Xu W，et al.Design，synthesis，and biological activities of novel ligustrazine derivatives[J].Bioorg Med Chem，2007，15(10):3315-3320.