TNF-α和IL-1β通過(guò)MAPK通路上調(diào)人支氣管平滑肌細(xì)胞的緩激肽受體和內(nèi)皮素受體

蔡 艷，楊旭東，雷 瑩

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，西安 710004；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，西安 710061；3.深圳華大生命科學(xué)研究院，深圳 518083)

氣道高反應(yīng)性(AHR)是哮喘最重要的臨床特征之一，AHR的病理過(guò)程與慢性氣道炎癥密切相關(guān)[1-3]。炎性介質(zhì)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)在慢性呼吸道炎癥發(fā)生期間被合成和釋放，且在哮喘患者的支氣管肺泡灌洗液中的水平增加[4]。研究發(fā)現(xiàn)，這2種細(xì)胞因子可促進(jìn)哮喘中的氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥[5-6]。

緩激肽、內(nèi)皮素-1和血栓素A2是重要的支氣管收縮物質(zhì)。緩激肽對(duì)非哮喘患者的肺和支氣管無(wú)明顯作用，但對(duì)哮喘患者的支氣管有顯著收縮作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，哮喘患者體內(nèi)的內(nèi)皮素-1和血栓素A2的水平顯著上調(diào)[8-10]。緩激肽和相關(guān)激肽，內(nèi)皮素-1和血栓素A2分別作用于各自的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)緩激肽B1和B2受體、內(nèi)皮素A型和B型受體以及血栓素A2受體，誘導(dǎo)支氣管收縮和引發(fā)炎性反應(yīng)。

以往研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α和IL-1β通過(guò)改變支氣管收縮物質(zhì)的G蛋白偶聯(lián)受體的表達(dá)，參與誘導(dǎo)了氣道高反應(yīng)性的發(fā)生。TNF-α和IL-1β通過(guò)激活離體小鼠氣管平滑肌細(xì)胞的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑，上調(diào)緩激肽B1和B2受體介導(dǎo)的收縮以及受體的表達(dá)[11-12]。以往研究證明，通過(guò)給予哮喘模型大鼠TNF-α受體進(jìn)行治療，可顯著降低內(nèi)皮素A受體(ETA)和內(nèi)皮素B受體(ETB)介導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性[13]。迄今為止，炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β與氣道收縮性物質(zhì)如緩激肽、內(nèi)皮素-1和血栓素A2在人氣道平滑肌細(xì)胞上的相互作用以及相關(guān)的信號(hào)調(diào)控通路仍不明確。本研究旨在探索TNF-α和IL-1β對(duì)人支氣管平滑肌細(xì)胞緩激肽B1和B2受體，內(nèi)皮素ETB受體和血栓素A2受體的影響，并發(fā)現(xiàn)其潛在的細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1儀器 T100熱循環(huán)儀，iQ5實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2試藥 TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-13，SP600125(1，9-吡唑烷酮)，SB203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亞磺?；交?-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)，U0126(1，4-二氨基-2，3-二氰基-1，4-雙-(2-氨基苯硫基)丁二烯)(美國(guó)Sigma公司)；LY294002(2-(4-嗎啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮)(美國(guó)Cayman Chemical公司)；吡啶-6(美國(guó)Santa Cruz公司)；SMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，聚-L-賴氨酸(美國(guó)ScienCell實(shí)驗(yàn)室)；RNAfast1000總RNA提取試劑盒(中國(guó)先鋒生物技術(shù)有限公司)；cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；FastStart Universal SYBR Green Master試劑盒(瑞士Roche公司)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 人支氣管平滑肌細(xì)胞(HBSMCs)，購(gòu)自美國(guó)ScienCell實(shí)驗(yàn)室，將細(xì)胞在平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基(SMEM)中以5×103個(gè)活細(xì)胞/cm2的密度接種在聚-L-賴氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。當(dāng)細(xì)胞超過(guò)90%融合時(shí)，將細(xì)胞傳代培養(yǎng)或移至24孔板中，在此階段添加細(xì)胞因子和抑制劑。

2 方法

2.1總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄到cDNA 總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄到cDNA使用RNAfast1000總RNA提取試劑盒提取總RNA。提取總RNA的質(zhì)量和數(shù)量分別用260/280 nm和260/230 nm的紫外吸光度值比進(jìn)行評(píng)估。所有RNA樣品均符合完整性標(biāo)準(zhǔn)，不含蛋白質(zhì)、有機(jī)物和基因組DNA污染物(即260/280 nm處的吸光度值比為1.8～2.1，260/230 nm處的吸光度值比為1.65～1.8)。使用T100熱循環(huán)儀，用cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒在20 μL體積反應(yīng)中進(jìn)行總RNA向cDNA的逆轉(zhuǎn)錄。將RNA在65 ℃孵育5 min變性。變性后，將RNA立即在冰中冷卻至少1 min，并將反轉(zhuǎn)錄母體混合物加入管中。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在42 ℃進(jìn)行1 h，70 ℃反應(yīng)10 min，后將cDNA在-80 ℃保存直到進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。

2.2實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(實(shí)時(shí)PCR) 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(實(shí)時(shí)PCR)使用FastStart Universal SYBR Green Master試劑盒在20 μL反應(yīng)中，于iQ5實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，95 ℃加熱10 min，隨后在95 ℃變性20 s，退火溫度20 s，72 ℃延伸30 s，55～100 ℃的熔解曲線為記錄。見表1。由表1可知，研究中使用的所有PCR引物均使用Oligo 6.65軟件設(shè)計(jì)，并通過(guò)DNA技術(shù)合成。采用ΔΔCT方法計(jì)算受體mRNA的相對(duì)量。將管家基因β-actin的mRNA的CT值作為使受體的mRNA的相對(duì)量標(biāo)準(zhǔn)化的參考。通過(guò)相同樣品中β-actin mRNA的CT值與受體mRNA的CT值的比值獲得mRNA的相對(duì)量。

2.3總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄 使用RNAfast1000總RNA提取試劑盒提取總RNA?？俁NA的提取質(zhì)量和數(shù)量分別用260/280 和260/230紫外吸光度值比進(jìn)行評(píng)估。所有RNA樣品均符合完整性標(biāo)準(zhǔn)，不含蛋白質(zhì)、有機(jī)物和基因組DNA污染物(即260/280吸光度值比為1.8～2.1，260/230吸光度值比為1.65～1.8)。使用T100熱循環(huán)儀，用cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒在20 μL體積反應(yīng)中進(jìn)行總RNA向cDNA的逆轉(zhuǎn)錄。RNA于65 ℃孵育5 min變性，之后置于冰中冷卻至少1 min，并將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系混合物按照建議比例加入管中。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在42 ℃進(jìn)行1 h，70 ℃反應(yīng)10 min，然后將得到的cDNA產(chǎn)物于-80 ℃保存至進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。

2.4實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(實(shí)時(shí)PCR) 使用FastStart Universal SYBR Green Master試劑盒在20 μL反應(yīng)中，于iQ5實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，95 ℃加熱10 min，隨后在95 ℃變性20 s，退火溫度20 s，72 ℃延伸30 s，記錄55～100 ℃的熔解曲線。由表1可知，所用引物信息，研究中使用的所有PCR引物均使用Oligo 6.65軟件設(shè)計(jì)，并通過(guò)DNA技術(shù)合成。采用ΔΔCT方法計(jì)算受體mRNA的相對(duì)量(相對(duì)量為相對(duì)于管家基因mRNA量的倍數(shù))。將管家基因β-actin的mRNA的CT值作為參比值，計(jì)算受體mRNA的相對(duì)量。通過(guò)相同樣品中β-actin mRNA的CT值與受體mRNA的CT值的比值獲得mRNA的相對(duì)量。

表1引物信息

Tab.1 Primer information

基因名序列ID序列長(zhǎng)度/bp退火溫度/℃β?actinNM＿001101．3F：5′?ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG?3′R：5′?AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG?3′17460B1RNM＿000710．3F：5′?ATATTCTGGGTTTCCTCCTAC?3′R：5′?GCTGTGGTCTTGCTATCC?3′12960B2RNM＿000623．3F：5′?AGGTGCTGCGGAACAACG?3′R：5′?GGAAGGTGCTGATCTGGAAGG?3′12860β2RNM＿000024．5F：5′?CCTATGGGAATGGCTACTC?3′R：5′?CCTTGTGAATCAATGTTATCG?3′16260ETBRNM＿000115．3F：5′?GCGAAACGGTCCCAATATC?3′R：5′?GCACATAGACTCAGCACAG?3′18560TXA2RNM＿001060．5F：5′?CCCTTCTGGTCTTCATCG?3′R：5′?CGGCGGAACAGGATATAC?3′15958

3 結(jié)果

3.1TNF-α上調(diào)HBSMCs中緩激肽B1和B2受體mRNA 將質(zhì)量濃度為1，10和100 ng·mL-1的TNF-α加入HBSMCs培養(yǎng)體系中24 h，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR測(cè)定緩激肽B1和B2受體、ETB受體、血栓素A2受體和β2腎上腺素受體的mRNA水平。見圖1。由圖1A可知，TNF-α增加了緩激肽B1和B2受體的mRNA水平，且這種效應(yīng)具有濃度依賴性，而ETB受體、血栓素A2受體或β2腎上腺素受體的mRNA水平不受TNF-α的影響。為了評(píng)估TNF-α的效應(yīng)-時(shí)間相關(guān)性，分別用質(zhì)量濃度為10 ng·mL-1的TNF-α處理HBSMCs 3，6，12，24和48 h。由圖1B可知，在未刺激的HBSMCs中可檢測(cè)到低水平的緩激肽B1和B2受體mRNA。6 h時(shí)，TNF-α增加了緩激肽B1和B2受體的mRNA水平，這種mRNA水平的增加可隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)至48 h。

3.2IL-1β上調(diào)HBSMCs中內(nèi)皮素B受體mRNA 將質(zhì)量濃度為1，10和 100 ng·mL-1的IL-1β加入HBSMCs培養(yǎng)體系中24 h，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR測(cè)定緩激肽B1和B2受體、ETB受體、血栓素A2受體和β2腎上腺素受體的mRNA水平。見圖2。由圖2A可知，IL-1β增加了ETB受體的mRNA水平，這種效應(yīng)具有濃度依賴性，而緩激肽B1和B2受體，血栓素A2受體或β2腎上腺素受體的mRNA水平不受IL-1β的影響。為了評(píng)估IL-1β的效應(yīng)-時(shí)間相關(guān)性，將質(zhì)量濃度為10 ng·mL-1的IL-1β加入HBSMCs培養(yǎng)體系中維持3，6，12，24和48 h。由圖2B可知，在未刺激的HBSMCs中可檢測(cè)到低水平的ETB受體mRNA。6 h時(shí)，IL-1β開始增加內(nèi)皮素B受體mRNA水平，這種效應(yīng)隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)至48 h。

圖1TNF-α刺激后HBSMCs中G蛋白偶聯(lián)受體的mRNA

Fig.1 G-protein coupled receptors mRNA in HBSMCs when stimulated with TNF-α

圖2IL-1β刺激后HBSMCs中G蛋白偶聯(lián)受體的mRNA

Fig.2 G-protein coupled receptors mRNA in HBSMCs when stimulated with IL-1β

見圖3。由圖3可知，IL-6(質(zhì)量濃度為1，10和100 ng·mL-1)和IL-13(質(zhì)量濃度為0.5，5和50 ng·mL-1)分別與HBSMCs共同孵育24 h后，對(duì)緩激肽B1和B2受體、ETB受體、血栓素A2受體和β2腎上腺素受體的mRNA水平均無(wú)顯著影響。

3.3TNF-α通過(guò)p38和JNK通路上調(diào)緩激肽B1和B2受體mRNA 為了確認(rèn)MAPK信號(hào)通路是否參與TNF-α對(duì)緩激肽B1和B2受體mRNA水平的上調(diào)作用，在質(zhì)量濃度為10 ng·mL-1的TNF-α加入前1 h，將p38 MAPK抑制劑SB203580(10 μmol·L-1)、c-Jun N-末端激酶(JNK)抑制劑SP600125(10 μmol·L-1)、MAPK/ERK激酶(MEK1/2)抑制劑U0126(10 μmol·L-1)、NF-κB通路IκB激酶(IKK)抑制劑TPCA-1(10 μmol·L-1)和相應(yīng)的空白溶劑加入到HBSMCs培養(yǎng)液中，分別與HBSMCs共同孵育24 h后，測(cè)試緩激肽B1和B2受體的mRNA水平變化，見圖4。由圖4A和4B可知，SB203580和SP600125降低了由TNF-α上調(diào)的緩激肽B1和B2受體mRNA水平，而U0126和TPCA-1未有明顯作用。

圖3IL-6和IL-13刺激后HBSMCs中G蛋白偶聯(lián)受體的mRNA

Fig.3 G-protein coupled receptors mRNA in HBSMCs when stimulated with IL-6 and IL-13

已報(bào)道Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)通路和Ⅰ類磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)通路參與調(diào)節(jié)TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞增殖。為了研究這些信號(hào)通路是否也參與調(diào)節(jié)緩激肽B1和B2受體mRNA水平，在質(zhì)量濃度為10 ng·mL-1的TNF-α加入前1 h加入泛JAK抑制劑吡啶-6(10 μmol·L-1)和PI3K抑制劑LY294002(10 μmol·L-1)至HBSMCs培養(yǎng)體系中。由圖4A和4B可知，它們都不影響緩激肽B1和B2受體的mRNA水平。

3.4IL-1β通過(guò)MEK1/2和下游IκB激酶上調(diào)內(nèi)皮素B受體Mrna 為了研究 MAPK信號(hào)通路是否參與IL-1β對(duì)ETB受體mRNA水平的上調(diào)作用，在質(zhì)量濃度為10 ng·mL-1的IL-1β加入前1 h，向HBSMCs培養(yǎng)體系中分別加入p38 MAPK抑制劑SB203580(10 μmol·L-1)，JNK抑制劑SP600125(10 μmol·L-1)，MEK1/2抑制劑U0126(10 μmol·L-1)和IκB激酶抑制劑TPCA-1(10 μmol·L-1)或空白溶劑。由圖4C可知，10 (〗μmol·L-1)〗的U0126和TPCA-1幾乎消除了IL-1β對(duì)ETB受體mRNA水平的上調(diào)作用，而SB203580和SP600125無(wú)顯著影響。

圖4MAPK與NF-κB通路參與上調(diào)TNF-α和IL-1β誘導(dǎo)的緩激肽受體和內(nèi)皮素受體mRNA

Fig.4 MAPK and NF-κB pathways were involved in TNF-αand IL-1βinduced upregulation of bradykinin receptors and endothelin receptor mRNA

本實(shí)驗(yàn)還研究了pan-JAK抑制劑吡啶-6(10 μmol·L-1)和PI3K抑制劑LY294002(10 μmol·L-1)是否參與IL-1β對(duì)HBSMCs中ETB受體mRNA水平的調(diào)節(jié)作用。由圖4C可知，它們均不影響ETB受體mRNA的水平。

4 討論

已有研究提出，促炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β在免疫反應(yīng)和變應(yīng)性哮喘炎癥發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[14]。之前的研究發(fā)現(xiàn)，抗TNF-α抗體英夫利昔單抗降低了過(guò)敏性哮喘模型大鼠支氣管收縮反應(yīng)，并減少了肺部的炎癥反應(yīng)[13]。本研究中，我們觀察了炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β與幾種重要的支氣管收縮劑(如緩激肽、血栓素A2和內(nèi)皮素-1)之間的相互作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TNF-α上調(diào)了緩激肽B1和B2受體mRNA，IL-1β上調(diào)了人支氣管平滑肌細(xì)胞中的ETB受體mRNA。P38MAPK抑制劑SB203580、JNK抑制劑SP600125、ERK1/2抑制劑U0126和IκB激酶抑制劑TPCA-1的干預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示MAPK通路參與這些上調(diào)機(jī)制。

哮喘患者對(duì)激肽類物質(zhì)表現(xiàn)出高反應(yīng)性[15]，且與正常人相比，過(guò)敏性呼吸道炎癥受試者的氣道中緩激肽B1和B2受體表達(dá)上調(diào)[16-17]。以往在小鼠氣管上的研究發(fā)現(xiàn)，緩激肽B1和B2受體都被TNF-α誘導(dǎo)上調(diào)[12]，本研究結(jié)果與這一發(fā)現(xiàn)相符，TNF-α同樣誘導(dǎo)人支氣管平滑肌細(xì)胞的緩激肽B1和B2受體mRNA上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，人支氣管平滑肌細(xì)胞在加入TNF-α后截至48 h，緩激肽B1和B2受體mRNA隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。其他小組對(duì)原代人氣管平滑肌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α增加了緩激肽誘導(dǎo)的胞質(zhì)游離Ca2+濃度上調(diào)，且需要至少6 h的刺激才可完成對(duì)Ca2+的動(dòng)員[16]，這一發(fā)現(xiàn)解釋了本研究中緩激肽B1和B2受體mRNA上調(diào)的起始時(shí)間為6 h。綜上所述，TNF-α可能通過(guò)增加氣道平滑肌表面緩激肽受體的表達(dá)來(lái)上調(diào)過(guò)敏性呼吸道炎癥患者對(duì)體內(nèi)緩激肽的反應(yīng)。

IL-1β是哮喘氣道平滑肌高反應(yīng)性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[19]。之前在小鼠氣管中的研究表明，IL-1β降低了ETB受體介導(dǎo)的收縮反應(yīng)，且氣管平滑肌中ETB受體mRNA被下調(diào)[20]。本研究顯示，IL-1β上調(diào)了人支氣管平滑肌細(xì)胞ETB受體mRNA。在離體人支氣管中，ETB受體分布于呼吸道平滑肌細(xì)胞并介導(dǎo)收縮反應(yīng)，而ETA受體存在于呼吸道上皮細(xì)胞中，介導(dǎo)一氧化氮的釋放，抵消收縮效應(yīng)[21]。與之不同的，小鼠氣管平滑肌中可同時(shí)檢測(cè)到ETA和ETB受體的功能和mRNA，且2種類型的受體均介導(dǎo)收縮反應(yīng)[20]。因此，人和小鼠呼吸道之間ETA和ETB受體的不同分布和功能可能是IL-1β對(duì)小鼠和人氣道平滑肌細(xì)胞的不同作用的一個(gè)解釋。

MAPK信號(hào)通路可誘導(dǎo)核因子κB(NF-κB)等轉(zhuǎn)錄因子，并參與受體的轉(zhuǎn)錄。以往研究表明，MAPK信號(hào)通路和下游NF-κB的激活可導(dǎo)致小鼠氣道平滑肌細(xì)胞中G蛋白偶聯(lián)受體的改變[22-23]。JNK抑制劑SP600125降低了TNF-α對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠氣管緩激肽B1和B2受體mRNA的上調(diào)[20]。本研究中，SB203580和SP600125降低了TNF-α誘導(dǎo)的HBSMCs中緩激肽B1和B2受體mRNA的上調(diào)，表明JNK和P38 MAPK途徑參與了該過(guò)程。因此，TNF-α和緩激肽之間的相互作用，很可能在人和小鼠氣道平滑肌細(xì)胞中經(jīng)由類似的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制發(fā)生。以往研究證實(shí)，MEK1/2信號(hào)通路參與調(diào)解大氣污染顆粒物對(duì)大鼠支氣管平滑肌ETB受體的上調(diào)作用[24]。在本研究中，MEK抑制劑U0126和IκB激酶抑制劑TPCA-1，顯著降低IL-1β上調(diào)的人氣道平滑肌細(xì)胞中ETB受體mRNA。因此，本研究為MEK1/2在呼吸道炎癥中調(diào)節(jié)ETB受體的表達(dá)提供了更多的證據(jù)。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)TNF-α上調(diào)HBSMCS中緩激肽B1和B2受體mRNA，IL-1β上調(diào)HBSMCS中內(nèi)皮素ETB受體mRNA。P38 MAPK抑制劑SB203580和JNK MAPK抑制劑SP600125顯著降低TNF-α上調(diào)的緩激肽B1和B2受體mRNA，MEK1/2抑制劑U0126和IκB激酶抑制劑TPCA-1顯著降低IL-1β上調(diào)的ETB受體mRNA。本研究為炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)的支氣管高反應(yīng)性的發(fā)生機(jī)制提供了進(jìn)一步的證據(jù)。

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