敲減CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α通過增加O-GlcNAc糖基化水平促進(jìn)肝癌細(xì)胞體外增殖*

李文姣，曹海超，馬瀾婧，張 松，丁美玲，張浩浩，聶勇戰(zhàn)

CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CCAAT/en-hancerbinding protein alpha，C/EBPα）是一種亮氨酸拉鏈蛋白，與能量代謝和細(xì)胞分化密切相關(guān)[1-5]。研究表明肝臟條件性C/EBPα敲除小鼠存在葡萄糖耐量異常，血清膽固醇減少及肝臟脂肪變，說明C/EBPα在肝臟的糖脂代謝穩(wěn)態(tài)發(fā)面發(fā)揮著重要的作用[6，7]。很多實(shí)體瘤C/EBPα表達(dá)下降，包括肝臟、乳腺、肺、前列腺、胰腺、膽囊和胃等[8-10]。臨床研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者癌和癌旁組織C/EBPα表達(dá)下降，并且與腫瘤的進(jìn)展和患者生存期降低密切相關(guān)[11，12]。O-GlcNAc糖基化修飾是一種重要的營養(yǎng)敏感糖修飾，由兩種關(guān)鍵的酶乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶（O-GlcNAc transferase，OGT）和乙酰葡糖胺水解酶（O-GlcNAcase，OGA）利用己糖胺代謝途徑的終產(chǎn)物鳥苷二磷酸氮乙酰葡糖胺（uridine diphosphate N-acetylglucosamine，UDP-G lc-NAc）來維持O-GlcNAc糖基化修飾的穩(wěn)態(tài)[13，14]。升高的O-GlcNAc糖基化修飾與多種代謝異常相關(guān)，如胰島素抵抗、肥胖、糖尿病以及腫瘤相關(guān)的代謝重編程[15]。在HCC患者癌組織中O-GlcNAc糖基化修飾表達(dá)上調(diào)，并與腫瘤的發(fā)生進(jìn)展以及肝移植后的腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)[16，17]。本研究發(fā)現(xiàn)敲減C/EBPα后在不同葡萄糖濃度下都會(huì)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的體外增殖，并能下調(diào)OGA的表達(dá)，從而升高細(xì)胞整體的O-GlcNAc糖基化修飾水平。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器 人肝癌細(xì)胞Hep3B由國家腫瘤生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；胎牛血清（FBS）、Opti-MEM和0.25%胰酶Trypsin購自Gibco公司；高糖DMEM和低糖DMEM購自美國Hyclone公司；青霉素 /鏈霉素（PS）、二甲基亞礬（DMSO）購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒購自ZETA LIFE公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TAKALA公司；化學(xué)發(fā)光儀、全自動(dòng)酶標(biāo)儀（BIO-RAD550）和Real-time PCR儀購自美國Bio-rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與低糖處理 配制含10%FBS的89%DMEM培養(yǎng)基和1%PS的培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞生長至80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶消化、傳代。接種6孔板，細(xì)胞在正常高糖培養(yǎng)基中貼壁生長24 h，用PBS清洗2遍，更換正常高糖（NG，4.5 g/L）或者低糖培養(yǎng)基（LG，1 g/L）。

1.3 慢病毒感染 取對(duì)數(shù)生長期的Hep3B細(xì)胞，將其鋪入24孔板，置于培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞密度達(dá)到50%～60%。將原培養(yǎng)基更換為Opti-MEM，并加入Polybrene至終濃度 5 μg/ml，然后加入靶向C/EBPα的RNAi慢病毒，對(duì)照組加入陰性對(duì)照病毒。常規(guī)培養(yǎng)16 h后，換為原培養(yǎng)液。細(xì)胞在感染病毒48～72 h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞所帶GFP綠色熒光。培養(yǎng)至細(xì)胞長滿約90%，轉(zhuǎn)入6孔板，加入終濃度2 μg/ml嘌呤霉素，篩選1～2 w，每2天換液，待培養(yǎng)液不再有漂浮的死細(xì)胞后篩選完畢。

1.4 細(xì)胞增殖檢測 使用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖活性。

1.5 細(xì)胞目標(biāo)分子mRNA水平檢測 采用qRT-PCR法，用TAKALA總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，定量。在20μl反應(yīng)體系中，含有總RNA 1000 ng，在 37℃，30 min，85℃，5 s的條件下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。采用SYBR green實(shí)時(shí)定量PCR法檢測目標(biāo)分子水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用2△△Ct進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 細(xì)胞目標(biāo)分子蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法，待細(xì)胞在正常高糖培基中貼壁后更換低糖培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24 h和48 h，提取總蛋白。經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)入PVDF膜上，用含有5%TBST的脫脂牛奶室溫孵育1 h，加入抗 C/EBPα（CST，1:1000稀釋）、抗 OGA（abcam，1：1000 稀釋）、抗 O-GlcNAc（novus，1：1000 稀釋），4℃搖床孵育過夜。次日，加TBST洗膜3次，每次5～10 min，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，洗膜3次，在化學(xué)發(fā)光液中顯影，結(jié)果用Lmage-lab圖像軟件分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)。應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建C/EBPα敲減Hep3B細(xì)胞系 利用RNAi慢病毒感染Hep3B細(xì)胞，構(gòu)建C/EBPα敲減細(xì)胞模型。由于重組質(zhì)粒的靶序列下游帶有綠色熒光蛋白基因，慢病毒感染48 h后在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光，說明插入的靶序列可以有效轉(zhuǎn)錄（圖1A）。經(jīng)嘌呤霉素篩選后，行C/EBPα敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系鑒定。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照細(xì)胞比，RNAi慢病毒感染細(xì)胞C/EBPα mRNA水平下調(diào)（7.5±2.3）倍（P＜0.05，圖 1B）；Western blot檢測結(jié)果顯示，RNAi慢病毒感染細(xì)胞C/EBPα蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)（圖1C），灰度值分析顯示C/EBPα敲減后蛋白表達(dá)水平下調(diào)了（8.8±0.25）倍（P＜0.001，圖 1D），上述結(jié)果證明 C/EBPα 敲減的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建成功。

圖1 成功構(gòu)建C/EBPα敲減Hep3B細(xì)胞系

2.2 敲減C/EBPα可促進(jìn)Hep3B細(xì)胞增殖 在我們的細(xì)胞培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)敲減C/EBPα后細(xì)胞的生長速度明顯快于對(duì)照組細(xì)胞。利用CCK-8實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞增殖活性，發(fā)現(xiàn)敲減C/EBPα可以促進(jìn)細(xì)胞增殖（圖2A）。在低葡萄糖（LG，1 g/L）條件下刺激48 h和72 h后，敲減C/EBPα分別促進(jìn)細(xì)胞增殖 15.4%（P＜0.05）和 25.0%（P＜0.01，圖 2B）。

圖2 敲減Hep3B細(xì)胞增殖加速

2.3 敲減C/EBPα增加O-GlcNAc糖基化修飾 在低葡萄糖刺激24 h和48 h后，敲減C/EBPα可以下調(diào)細(xì)胞OGA蛋白表達(dá)水平（圖3A）?；叶确治鲲@示，與對(duì)照組比，敲減C/EBPα細(xì)胞在正常高糖及低糖刺激24 h和48 h時(shí)，OGA蛋白表達(dá)分別下調(diào)了70.1%（P＜0.01）、51.4%（P＜0.05）和 61.2%（P＜0.05，圖3B）。而整體O-GlcNAc糖基化水平高于對(duì)照組?；叶确治鲲@示，在低糖作用48 h時(shí)，灰度值升高80.6%（P＜0.05，圖 3C），說明下調(diào) C/EBPα 可以影響細(xì)胞整體O-GlcNAc糖基化修飾狀態(tài)，而OGA表達(dá)下調(diào)可以在一定程度上解釋O-GlcNAc糖基化修飾的改變。在正常高糖條件下，敲減C/EBPα后細(xì)胞OGA mRNA水平有下調(diào)趨勢，但無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。當(dāng)給予低葡萄糖刺激后OGA mRNA水平升高，在48 h時(shí)其水平增加了77.4%（P＜0.05，圖3D）。

圖3 敲減C/EBPα增加O-GlcNAc糖基化修飾

3 討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)敲減C/EBPα后明顯促進(jìn)了Hep3B肝癌細(xì)胞的增殖速率，并且在低葡萄糖的營養(yǎng)狀態(tài)下這種促進(jìn)作用更為明顯。既往研究發(fā)現(xiàn)HCC患者癌組織比癌旁組織C/EBPα表達(dá)下降，而這種變化與腫瘤轉(zhuǎn)移和臨床不良預(yù)后密切相關(guān)，有望成為評(píng)價(jià)HCC預(yù)后的新指標(biāo)[18，19]。在小鼠肝癌模型，肝臟特異性的C/EBPα敲入可明顯減小瘤體的形成，降低腫瘤的增殖能力[20]。目前，已設(shè)計(jì)出C/EBPα短激活 RNA（small-activating RNA，saRNA）來增加C/EBPα轉(zhuǎn)錄水平。在HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染C/EBPα的saRNA后細(xì)胞白蛋白的分泌可以增加3倍左右，腫瘤細(xì)胞的增殖速率降低50%左右。在動(dòng)物模型中，當(dāng)給肝硬化伴多病灶肝癌的大鼠尾靜脈注射C/EBPα的saRNA后，大鼠血清白蛋白增加了超過30%，并且谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶都有一定程度的升高。另外，注射C/EBPα saRNA后大鼠的腫瘤負(fù)荷降低約80%，并抑制甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）的表達(dá)[21]。在肝臟原位移植瘤注射C/EBPα的saRNA后可以抑制原位移植瘤的形成以及肝內(nèi)和遠(yuǎn)處肺臟轉(zhuǎn)移瘤的形成。這些研究為C/EBPα治療HCC提供了新的思路和方法。

本研究發(fā)現(xiàn)在C/EBPα敲減后細(xì)胞OGA表達(dá)下調(diào)，整體的O-GlcNAc糖基水平升高。既往研究發(fā)現(xiàn)在HCC患者的癌組織O-GlcNAc水平明顯高于癌旁組織，而且在肝移植后復(fù)發(fā)性HCC組織中O-GlcNAc高于未復(fù)發(fā)組。OGA是O-GlcNAc糖基化修飾的特異水解酶，OGA的表達(dá)降低可以作為肝癌肝移植后是否復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。本實(shí)驗(yàn)中，在低糖刺激的條件下OGA mRNA水平明顯升高，說明還存在其他的調(diào)節(jié)機(jī)制調(diào)節(jié)OGA的表達(dá)，這些有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

總的來說，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲減C/EBPα在正常高糖和低糖條件下均可以明顯促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖，敲減C/EBPα后，重要的營養(yǎng)感知因子O-GlcNAc糖基化水平整體升高，OGA表達(dá)有所下調(diào)，可能是敲減C/EBPα促HCC發(fā)生新的作用機(jī)制。隨著對(duì)于C/EBPα靶向saRNA的研究進(jìn)展，基于C/EBPα在肝臟能量代謝和肝癌抑制方面的雙重作用，C/EBPα有望成為靶向治療HCC的新靶點(diǎn)。

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