人臍帶間充質(zhì)干細胞肝內(nèi)移植聯(lián)合苦參素治療失代償期乙型肝炎肝硬化患者療效與轉(zhuǎn)歸分析

趙宇，祝瑜，張代忠

5%慢性乙型肝炎患者可發(fā)展為肝硬化。一旦進入肝功能失代償期，常規(guī)保肝治療效果并不理想，病死率較高[1]。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有強大的自我更新能力，能分化成各種中胚層和內(nèi)外胚層細胞，具有促進肝臟再生和抗肝纖維化的作用。人臍帶間充質(zhì)干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）來源廣泛，易于培養(yǎng)，已成為臨床治療失代償期乙型肝炎肝硬化的重要手段[2]。苦參素是從苦參中提取的生物堿，其中氧化苦參堿（oxymatrine，OM）的含量高達98%，具有抗病毒、抗纖維化、抗病毒等多種藥理作用。有研究報道，苦參素能提高乙型肝炎患者免疫功能和抑制HBV復制[3]，但其聯(lián)合UC-MSCs用于治療失代償期乙型肝炎肝硬化患者的研究報道尚少。本研究采用HUMSC移植聯(lián)合苦參素治療失代償期乙型肝炎肝硬化患者，觀察了血清肝纖維化、肝功能和免疫功能指標的變化及其對患者預后的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年1月～2015年12月我院收治的失代償期乙型肝炎肝硬化患者68例，男性38例，女性30例；年齡33～70歲，平均年齡（45.3±4.9）歲。臨床診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》[4]的標準，血清 HBV DNA＞1×103拷貝/毫升。肝功能Child-Pugh B級28例，C級40例。排除標準：合并甲型肝炎、丙型肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎等引起的肝硬化；嚴重的心、腎、肺、腦等臟器功能異常；入組前2個月內(nèi)出現(xiàn)過終末期肝硬化的嚴重并發(fā)癥，如消化道出血、急慢性感染等；惡性腫瘤；精神疾患；過敏體質(zhì)。采用隨機數(shù)字表法將患者分為觀察組34例和對照組34例，兩組患者性別、年齡、肝功能分級比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核通過，患者了解研究內(nèi)容并自愿簽署知情同意書。

1.2 治療方法 入院后給予兩組患者護肝、抗病毒、對癥支持治療。在此基礎(chǔ)上，在對照組，給予經(jīng)肝動脈途徑移植UC-MSCs治療。UC-MSCs制備：收集足月妊娠健康胎兒產(chǎn)后臍帶，征得產(chǎn)婦及其家屬授權(quán)并簽署知情同意書。采用胰酶和膠原酶順序消化法分離，貼壁培養(yǎng)分離純化HUMSC，并行細胞表型鑒定，制成UC-MSCs細胞懸液10 mL，細胞數(shù)量≥2×107。UC-MSCs移植方法：術(shù)前1 d行碘過敏試驗和雙側(cè)腹股溝備皮，術(shù)前4 h禁水，在數(shù)字減影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）下行股動脈穿刺插管至肝固有動脈，確定肝內(nèi)無占位性病變后，將UC-MSCs細胞懸液10 mL經(jīng)左右肝動脈緩慢注入，術(shù)畢拔管，局部加壓包扎，穿刺側(cè)下肢制動6 h；觀察組在對照組治療的基礎(chǔ)上給予苦參素膠囊0.2口服，3次/d，持續(xù)用藥12個月。

1.3 檢測 使用日本奧林巴斯公司生產(chǎn)的AU5400型全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、白蛋白（albumin，ALB）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）；采用比濁法檢測凝血酶原時間（PT，美國貝克曼庫爾特公司），并計算國際標準化比值（international normalized ratio，INR）；采用放射免疫法測定血清層粘連蛋白（laminin，LN）、透明質(zhì)酸（haluronic acid，HA）、Ⅳ型膠原（type IV-collagen，Ⅳ-C）、Ⅲ型前膠原（procollagenⅢ，PCⅢ，北京北方科技研究所）；使用FACSCallbur型流式細胞儀測定外周血T淋巴細胞亞群（美國BD公司）。

1.4 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料的比較采用x2檢驗，計量資料以±s表示，采用t檢驗。P＜0.05提示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 在治療期間，觀察組2例因肝衰竭并發(fā)感染死亡，1例因肝性腦病死亡，無失訪病例；對照組1例因肝衰竭死亡，1例因發(fā)生肝腎綜合征死亡，2例發(fā)生消化道大出血死亡，無失訪病例。

2.2 兩組治療前后肝功能指標的比較 治療前兩組血清ALT、INR、ALB、TBIL比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；治療12個月，觀察組血清ALT和TBIL顯著低于對照組（P＜0.05），但INR和ALB比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1）。

2.3 兩組治療前后血清肝纖維化指標比較 治療前兩組血清LN、HA、Ⅳ-C、PCⅢ水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；治療12個月，觀察組血清LN、HA、Ⅳ-C、PCⅢ水平明顯低于對照組（P＜0.05，表2）。

2.4 兩組治療前后外周血T淋巴細胞亞群比較 治療前兩組患者外周血CD4+、CD8+細胞百分比和CD4+/CD8+比值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；治療12個月，觀察組CD4+細胞百分比和CD4+/CD8+比值顯著高于對照組，CD8+細胞顯著低于對照組（P＜0.05，表3）。

表1 兩組肝功能指標（±s）比較

表1 兩組肝功能指標（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05

?

表2 兩組血清肝纖維化指標（±s）比較

表2 兩組血清肝纖維化指標（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05

?

表3 兩組外周血T淋巴細胞亞群（±s）比較

表3 兩組外周血T淋巴細胞亞群（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05

?

2.5 兩組肝移植和肝癌發(fā)生情況比較 治療12個月，兩組行肝移植或肝癌發(fā)生率無統(tǒng)計學差異（P＞0.05，表4）。

表4 兩組肝移植和肝癌發(fā)生率（%）比較

3 討論

失代償期肝硬化是多種慢性肝炎發(fā)展至終末階段的表現(xiàn)，5 a生存率僅為14%[5]，目前尚無治療失代償期肝硬化的特效療法。自1966年Friedenstein et al[6]從骨髓中發(fā)現(xiàn)MSCs以來，受到國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注及深入研究，成為細胞或組織替代治療研究的熱點[7]。臍帶是MSCs最主要和較為理想的細胞來源之一，取材方便，來源廣，對孕婦、胎兒均無影響；具有干細胞增殖能力強的特點，在成熟的體位培養(yǎng)擴增技術(shù)支持下，可獲得足量的細胞數(shù)，有利于促進骨髓間質(zhì)的分化；其免疫原性低，且具有免疫調(diào)節(jié)作用，不會產(chǎn)生排斥反應(yīng)，安全性高；病毒和病原微生物的感染風險低[8，9]。方雪晴等[10]指出，UC-MSCs治療失代償期肝硬化可減輕肝細胞破壞，降低肝衰竭發(fā)生率。應(yīng)用UC-MSCs通過不同途徑移植治療肝硬化患者已在臨床較廣泛地試驗。UC-MSCs介入移植減少肝組織內(nèi)的膠原沉積，抑制肝細胞內(nèi)α-平滑肌激動蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β）表達，降低LN、HA、Ⅳ-C水平，并持續(xù)分泌白蛋白，減輕肝纖維化，改善肝功能[11]。動物實驗研究表明，MSCs在減輕肝纖維化大鼠肝纖維化程度，改善肝功能方面有積極的作用[12]。

苦參素膠囊是從苦參根或苦豆子中提取，OM含量高達98%?，F(xiàn)代藥理學研究表明，苦參素具有抑制HBV復制、清除氧自由基、抗肝細胞凋亡、抗肝纖維化等多種藥理作用[13，14]。陳佳欣等[15]以恩替卡韋耐藥乙型肝炎病毒輔助細胞株HepG2.A64為模型，觀察了恩替卡韋單獨用藥或恩替卡韋聯(lián)合OM用藥的細胞毒性，發(fā)現(xiàn)與單獨用藥相比，恩替卡韋聯(lián)合OM可顯著增強抗病毒效果。苦參素膠囊輔助治療慢性乙型肝炎患者，可明顯改善肝纖維化，促進肝功能恢復。與恩替卡韋單獨用藥比較，苦參素聯(lián)合恩替卡韋治療失代償期肝硬化可明顯改善肝纖維化及肝功能指標。

本研究觀察治療12個月，觀察組患者血清ALT、TBIL、LN、HA、Ⅳ-C、PCⅢ水平均低于對照組（P＜0.05），說明苦參素聯(lián)合HU-MSCs在減輕肝纖維化和改善肝功能方面效果明顯，考慮與苦參素聯(lián)合HU-MSCs治療具有協(xié)同抗肝纖維化的作用有關(guān)。MSCs可通過分泌可溶性細胞因子和直接的細胞接觸介導免疫抑制及誘導免疫耐受，對T細胞、B細胞、NK細胞增殖和分化均具有抑制作用，刺激調(diào)節(jié)性T細胞的增殖，對免疫反應(yīng)進行調(diào)控[16-19]。OM具有抑制HBV DNA復制，提高機體免疫功能，增強細胞免疫反應(yīng)的作用[20]。本研究觀察組治療后免疫功能改善情況優(yōu)于對照組，考慮與苦參素和HU-MSCs均具有免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

綜上所述，與單獨UC-MSCs移植相比，苦參素膠囊聯(lián)合UC-MSCs移植治療失代償期乙型肝炎肝硬化患者具有協(xié)同作用，可明顯改善肝功能及免疫功能，延緩肝纖維化的發(fā)展。本研究還存在一些局限性，如納入樣本量較少，有待擴大研究范圍，進行多中心、前瞻性研究，以提高研究結(jié)果的客觀性。本研究僅觀察了治療12個月肝功能和肝纖維化指標的變化，觀察時間短，有待進一步延長隨訪時間，了解遠期預后。由于肝硬化具有不可逆轉(zhuǎn)性，而UC-MSCs在人體內(nèi)停留時間較短，如增加UC-MSCs移植次數(shù)是否可更長時間地維持臨床效果尚有待進一步觀察。

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