重組單克隆抗體生產(chǎn)的宿主細胞系的研究進展

劉素霞

摘要：許多表達系統(tǒng)可以表達單克隆抗體，并且也在研究中。CHO細胞是最常用于研究的細胞系，直到今天仍然是單克隆抗體生產(chǎn)的主力。對宿主細胞系進行改造提高產(chǎn)品產(chǎn)量及質(zhì)量，不同的宿主細胞系生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量存在差異。

關鍵詞：中國倉鼠卵巢；單克隆抗體；哺乳動物表達系統(tǒng)

1 歷史和科學背景

單克隆抗體（MonoclonalAntibody，mAb）在重組蛋白藥物中占比最大，不僅可以用于人類疾病的治療，還可用于多種疾病的體內(nèi)成像診斷。

20世紀60年代，人們開始培養(yǎng)骨髓瘤細胞，并且通過化學或輻射方法處理后建立了營養(yǎng)缺陷型細胞株。1975年雜交瘤技術發(fā)表，制藥行業(yè)很快意識到mAb將成為重磅炸彈。OKT3是第一個動物細胞生產(chǎn)的小鼠mAb，作用于人類T淋巴細胞，用于抑制腎移植手術后的異體排斥。

人們對轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因動物以及體外翻譯系統(tǒng)已經(jīng)研究了數(shù)十年，這些生產(chǎn)系統(tǒng)主要的難點是產(chǎn)品效價不足，另外，轉(zhuǎn)基因植物常常存在多余的糖基化或蛋白水解活性，造成下游操作程序復雜、低效。

2 mAb生產(chǎn)的宿主細胞系

用于重組mAb表達的宿主細胞系主要是CHO，NS0，Sp2/0，HEK293和PER.C6。但是，被批準用于人類治療mAbs生產(chǎn)的細胞系僅有CHO，NS0和Sp2/0。其中，CHO細胞占據(jù)了當今工業(yè)生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物的70%。[1]

1986年，首個重組生物藥tPA被批準上市，CHO細胞作為其表達系統(tǒng)也成為重組蛋白表達的首選細胞系。目前，CHO細胞系的mAb生產(chǎn)工藝已經(jīng)相當成熟，通常批次生產(chǎn)的產(chǎn)量最高可達到1 g/L，流加培養(yǎng)可達到110 g/L。[2]

鼠源細胞系的NS0和Sp2也可用于重組mAb生產(chǎn)，NS0細胞的細胞密度和mAb表達量通常會比CHO細胞的批次培養(yǎng)低10倍。HEK和PER.C6細胞可以表達與人類蛋白質(zhì)糖基化一致的mAb，HEK293細胞尤其適用于瞬時基因表達，可以在DNA轉(zhuǎn)染后幾天內(nèi)收獲蛋白質(zhì)。

3 mAb生產(chǎn)的宿主細胞工程

研究者們通過過量表達或敲除某個基因，調(diào)整代謝途徑、延緩細胞凋亡、增強轉(zhuǎn)錄表達效率，有效的增加了重組蛋白產(chǎn)量。在重組 CHO 中表達酵母PYC2，可以改變流加培養(yǎng)方式中葡萄糖的代謝速率，增長細胞的對數(shù)生長期，從而增加細胞密度及產(chǎn)量。應用鋅指結(jié)構核酸酶完全敲除CHO 細胞的Bak和Bax基因，IgG表達提高25倍。[3]

4 mAb生產(chǎn)中的“產(chǎn)品質(zhì)量”

在不同細胞系統(tǒng)中表達的mAb的一級序列主要由轉(zhuǎn)入基因的密碼子決定，但翻譯后修飾決定了重組蛋白質(zhì)的微觀不均一性，并對其溶解度，穩(wěn)定性，藥代動力學，效力和生物活性具有顯著影響。

蛋白質(zhì)的糖基化可影響蛋白質(zhì)的藥理活性、生理生化特性以及藥代動力學性質(zhì)，半乳糖基化對于介導補體依賴性細胞毒性（CDC）是相當重要的。α1，6巖藻糖基通過與FcγRIIIa受體的特異性抗體結(jié)合，從而在抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）中起作用，CHO表達的mAb含有高達90%的巖藻糖化，通過基因工程改造使其缺乏α1，6巖藻糖基，可增加mAb的ADCC活性。唾液酸化有利于增加mAb的血清半衰期，但也有報道說末端唾液酸會減少ADCC活性。[4]

將mAb應用于體內(nèi)之前，需要嚴格控制產(chǎn)品的質(zhì)量，蛋白質(zhì)的結(jié)構、環(huán)境條件或生產(chǎn)過程等因素使得重組蛋白在生產(chǎn)及儲存過程中可能會發(fā)生聚集，形成較大顆粒，若是治療性蛋白質(zhì)可能會因此失去生物活性，甚至出現(xiàn)免疫反應或其他副作用。[5]

5 mAb生產(chǎn)的現(xiàn)有及先進技術

細胞培養(yǎng)技術在過去幾十年里已經(jīng)相當成熟，并逐漸發(fā)展成為一種相對可靠和強大的技術。大約30年前，“老”生物過程通常以分批模式運行一周，最大細胞濃度為3×106cells/ mL，重組蛋白產(chǎn)量約為100 mg/L。二十年后，由于改善了基礎培養(yǎng)基以及補料策略，mAb表達量達到15g/L。現(xiàn)在，生產(chǎn)工藝得到進一步的發(fā)展，產(chǎn)品表達量可以超過10 g/L。

物理參數(shù)（例如溫度，氣體流量），化學參數(shù)（例如pH，滲透壓，溶氧）和生物學參數(shù)（例如細胞密度，存活力，細胞周期）都會顯著影響產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)效率，特別是對產(chǎn)品的糖基化，翻譯后修飾水平和雜質(zhì)類型方面有顯著影響。要獲得符合質(zhì)量要求且產(chǎn)量高的mAb，培養(yǎng)操作參數(shù)的優(yōu)化是極其重要的。

6 結(jié)論

大約75%的科學出版物從一開始就使用CHO細胞。因此，在接下來的幾十年中，CHO細胞可能仍然是哺乳動物細胞培養(yǎng)中蛋白質(zhì)表達的主力。與此同時，已經(jīng)開展了許多替代表達系統(tǒng)的開發(fā)，特別是對于一些新形式或人工改造的mAb變體。只要它們能夠達到期望的質(zhì)量，甚至可以在低等真核生物或原核生物中表達。

參考文獻：

[1]Valente KN，Levy NE，Lee KH.Applications of proteomic methods for CHO host cell protein characterization in biopharmaceutical manufacturing.Curr Opin Biotechnol.2018，53：144150.

[2]Wang W，Zheng W，Hu F，et al.Enhanced Biosynthesis Performance of Heterologous Proteins in CHOK1 Cells Using CRISPRCas9.ACS Synth Biol.2018，7（5）：12591268.

[3]Toussaint C，Henry O，Durocher Y.Metabolic engineering of CHO cells to alter lactate metabolism during fedbatch cultures.J.Biotechnol，2015，217：122131.

[4]黃嘉慧，汪才坤，覃錦紅，等.N糖基化對TNFRFc融合蛋白結(jié)構穩(wěn)定性和生物活性的影響.中國生物工程雜志，2016（5）：1219.

[5]李敏，常衛(wèi)紅.生物制品質(zhì)量標準研究與建立一般原則的探討.中國新藥雜志，2017，26（16）：18871893.