橡膠樹(shù)β—淀粉酶基因HbBAM1的克隆與表達(dá)分析

陽(yáng)江華 龍翔宇 秦云霞 唐朝榮

摘 要 葉綠體內(nèi)的淀粉是植物光合作用產(chǎn)物的重要臨時(shí)儲(chǔ)存形式，這些淀粉的降解需要β-淀粉酶（BAM）。β-淀粉酶基因是一個(gè)多基因家族，分別在不同組織中起著不同的作用，葉綠體β-淀粉酶在葉綠體淀粉降解過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。利用橡膠樹(shù)的轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)RT-PCR的方法獲得一個(gè)橡膠樹(shù)BAM基因，命名為HbBAM1。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析其在葉片中的表達(dá)模式，通過(guò)原核表達(dá)獲得其重組蛋白，并分析其酶活性特點(diǎn)。同源性分析和亞細(xì)胞預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明，HbBAM1定位于葉綠體中；HbBAM1原核表達(dá)產(chǎn)物的最適酶活性溫度是35 ℃，其酶活性受到氧化型谷胱甘肽和雙氧水等氧化劑的抑制。HbBAM1基因主要在橡膠樹(shù)的花和葉片中表達(dá)；HbBAM1基因隨著葉片的發(fā)育進(jìn)程表達(dá)量逐漸增加，在淡綠期和穩(wěn)定期葉片中表達(dá)量最大；HbBAM1基因在成熟葉片中的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的晝夜差異，在光合作用最強(qiáng)的上午10：00和下午16：00的表達(dá)量最大，晚上的表達(dá)量最低。上述結(jié)果表明，HbBAM1可能參與橡膠樹(shù)葉片葉綠體內(nèi)淀粉的降解，控制葉片氣孔的開(kāi)放與關(guān)閉，從而調(diào)控橡膠樹(shù)葉片的光合作用。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹(shù)；β-淀粉酶；HbBAM1；葉綠體

中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract In chloroplast，starch is an important temporary storage form of photosynthetic products， and the degradation of the starch requires β-amylase（BAM）activity. β-amylase is a multi-gene family， which has different functions in different tissues. Plastic β-amylase plays a key role in starch degradation in chloroplast. Based on the transcriptome and genome data，an β-amylase gene， HbBAM1 was cloned by RT-PCR from Hevea brasiliensis. Real time RT-PCR（qRT-PCR）was used to characterize the expression pattern of HbBAM1 in the leaves. The recombinant protein of HbBAM1 was obtained by prokaryotic expression， and the characteristics of the enzyme activity was analyzed. HbBAM1 located in the chloroplast based on homology analysis and subcellular prediction. The optimum enzyme temperature of HbBAM1 was 35 ℃， the enzyme was suppressed by oxidant，oxidized glutathione and hydrogen peroxide. HbBAM1 was mainly expressed in the flowers and leaves. The expression of HbBAM1 was gradually increased in the leaf development process，peaked at the light green and stable stages. HbBAM1 displayed obvious circadian variations in the stable leaves，which had the highest expression level during the strongest photosynthesis time-10 oclock and 16 oclock， the lowest at night. It was presumed that HbBAM1 maight participate in the starch degradation in the chloroplast of H. brasiliensis，control the open and close of the stomas，regulates the photosynthesis of H. brasiliensis.

Key words Hevea brasiliensis； β-amylase； HbBAM1； chloroplast

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.015

植物葉肉細(xì)胞的葉綠體、種子和塊莖等淀粉貯藏器官中均含有豐富的淀粉。β-淀粉酶（β-amylase，BAM）通過(guò)水解α-1，4-葡聚糖鏈，從淀粉的非還原性末端逐次以麥芽糖為單位切斷，產(chǎn)生麥芽糖[1]。早期對(duì)β-淀粉酶的研究主要集中在長(zhǎng)期存儲(chǔ)淀粉的農(nóng)作物種子或者塊莖的農(nóng)作物，如大麥、甘薯和大豆[2-4]。近年來(lái)，研究重點(diǎn)才轉(zhuǎn)向研究β-淀粉酶在植物葉片淀粉代謝中的作用及β-淀粉酶在植物面臨各種環(huán)境脅迫時(shí)的作用[5-6]。

在植物葉片淀粉的分解過(guò)程中，α-淀粉酶起著次要作用[7]，而植物β-淀粉酶起著關(guān)鍵作用[8-10]。β-淀粉酶是多基因家族，在擬南芥中有9個(gè)BAM基因，分為4個(gè)亞類，BAM1和BAM3是主要的負(fù)責(zé)淀粉降解的β-淀粉酶基因。在未開(kāi)花的擬南芥幼嫩葉片中，BAM1主要在保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)，在白天通過(guò)降解淀粉，開(kāi)啟氣孔[11]。BAM1的突變體bam1，其保衛(wèi)細(xì)胞中含有更多的淀粉，減少氣孔的打開(kāi)，提高了bam1對(duì)滲透脅迫和干旱脅迫的耐受能力[11-12]。BAM3主要在晚上起作用，通過(guò)降解淀粉生成麥芽糖，為晚上植物的生長(zhǎng)提供碳源。寒冷脅迫會(huì)上調(diào)擬南芥AtBAM3基因的表達(dá)[10]。在國(guó)內(nèi)，Peng等[13]研究了枳樹(shù)中擬南芥AtBAM3的同源基因PtrBAM1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PtrBAM1基因的表達(dá)受到CBF轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，通過(guò)提高可溶性糖的含量，提高了枳樹(shù)的耐寒能力。擬南芥的BAM4雖然沒(méi)有β-淀粉酶活性，但其缺失突變體bam4的葉片淀粉降解受到抑制，其淀粉含量比野生型更高，BAM4可能以獨(dú)立于BAM1和BAM3的途徑，促進(jìn)或者調(diào)控?cái)M南芥的淀粉降解[14]。

本研究利用橡膠樹(shù)轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，從橡膠樹(shù)中獲得一個(gè)擬南芥AtBAM1的同源基因HbBAM1，分析HbBAM1基因在同一天內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化，確定HbBAM1原核表達(dá)產(chǎn)物的最適酶活性溫度，以及不同氧化劑對(duì)其酶活性的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 巴西橡膠樹(shù)，定植于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)3隊(duì)，品系為熱研7-33-97。

1.1.2 試劑和菌種 PCR產(chǎn)物克隆用的T載體為大連寶生物公司的pMD18-T，Taq DNA聚合酶和熒光定量試劑TransStart Tip Green qPCR SuperMix為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，蛋白預(yù)染marker、限制性核酸內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國(guó)Thermo Scientific公司產(chǎn)品。DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒為美國(guó)Omega公司產(chǎn)品。通用植物總RNA提取試劑盒為北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。原核表達(dá)載體pGEX-4T-1和pET43.1a，大腸桿菌菌種Top10和BL21（DE3），為本實(shí)驗(yàn)室保存。引物由上海英俊生物技術(shù)公司合成，DNA測(cè)序在上海生工生物工程有限公司完成?？扇苄缘矸蹫镾igma公司產(chǎn)品，其它生化試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理 7個(gè)不同組織的實(shí)驗(yàn)材料采自10年生、開(kāi)割3 a的未進(jìn)行乙烯利刺激割膠的橡膠樹(shù)。不同時(shí)間點(diǎn)的葉片取自定植4 a的橡膠樹(shù)的成熟期葉片的葉肉部分，以3株橡膠樹(shù)的葉片混合為1個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)，共3個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 巴西橡膠樹(shù)不同組織的總RNA的提取，使用百泰克公司的通用植物總RNA提取試劑盒，方法參照說(shuō)明書(shū)。cDNA第一鏈的合成使用Thermo Scientific公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，操作步驟依照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 HbBAM1基因的克隆 通過(guò)搜索巴西橡膠樹(shù)的轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得了AtBAM1基因在橡膠樹(shù)中的同源基因HbBAM1的cDNA序列。設(shè)計(jì)了1對(duì)基因特異性引物HbBAM1-F和HbBAM1-R，以雄花和雌花的cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳顯示，PCR產(chǎn)物為單一的條帶。該條帶經(jīng)回收后，連接到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑選5個(gè)經(jīng)菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆，送上海英俊生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。引物序列見(jiàn)表1。

1.2.4 HbBAM1基因的表達(dá)分析 HbBAM1基因的熒光定量PCR引物qBAM1-F和qBAM1-R，經(jīng)測(cè)序確定引物正確。使用伯樂(lè)公司的CFX96 TOUCH實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，分析HbBAM1基因在不同組織、葉片不同時(shí)期和一天不同時(shí)間點(diǎn)葉片的表達(dá)變化。不同組織和葉片不同時(shí)期的內(nèi)參基因?yàn)镽H2b，一天不同時(shí)間點(diǎn)葉片的內(nèi)參基因?yàn)閁BC2a。內(nèi)參基因的引物參照Li等[15]的論文。

1.2.5 HbBAM1原核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá) 由于HbBAM1定位于葉綠體上，其定位于葉綠體的信號(hào)肽為疏水結(jié)構(gòu)，可能會(huì)影響HbBAM1在大腸桿菌的表達(dá)，原核表達(dá)去除了HbBAM1的信號(hào)肽序列。以yBAM1-F 和yBAM1-R為引物，從第76個(gè)氨基酸開(kāi)始，擴(kuò)增HbBAM1基因的編碼區(qū)序列。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、原核表達(dá)載體pGEX-4T-1和pET43.1a都使用Bam HI和Sal I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收、連接轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)。挑選陽(yáng)性克隆，DNA測(cè)序確認(rèn)正確的克隆，成功構(gòu)建了HbBAM1的pGEX-4T-1和pET43.1a中的原核表達(dá)載體，分別命名為pGEX-HbBAM1和pET43-HbBAM1。構(gòu)建完成的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸表達(dá)菌種BL21（DE3），對(duì)HbBAM1進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，其誘導(dǎo)條件為：IPTG濃度為0.5 mmol/L，16 ℃誘導(dǎo)20 h。

1.2.6 HbBAM1重組蛋白的酶活性分析 超聲破碎經(jīng)IPTG誘導(dǎo)BL21（DE3）菌，13 000 r/min，10 min高速離心，分離上清和沉淀，沉淀用和上清相同體積的無(wú)菌水重懸，10%聚丙烯胺濃度的SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)。取約0.5 μg未經(jīng)純化pET43-HbBAM1重組蛋白，用于最適酶活性溫度的測(cè)定，以及不同濃度氧化型谷胱甘肽和雙氧水對(duì)酶活性的抑制實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系為100 μL，含100 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉（pH5.6），1%的可溶性淀粉，分別置于不同溫度的水浴中，測(cè)定pET43-HbBAM1重組蛋白的最適酶活性溫度。抑制劑實(shí)驗(yàn)：分別加入不同濃度的氧化劑，其它反應(yīng)體系與酶活性溫度測(cè)定相同，反應(yīng)溫度為35 ℃。所有酶反應(yīng)均在冰上混勻后，置于相應(yīng)溫度的水浴中反應(yīng)15 min，然后分別加入900 μL的麥芽糖顯色溶液（1%的3，5-二硝基水楊酸，30%的酒石酸鉀鈉，0.4 N的NaOH）終止反應(yīng)，最后于100 ℃反應(yīng)5 min顯色，測(cè)定吸光值OD520。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbBAM1基因全長(zhǎng)cDNA的克隆

經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證，獲得了HbBAM1基因全長(zhǎng)cDNA序列，全長(zhǎng)1 913 bp，其中編碼區(qū)長(zhǎng)1 752 bp，共編碼583個(gè)氨基酸序列。與擬南芥的HbBAM1的氨基酸序列同源性為75.7%。用Mega7.0[16]對(duì)HbBAM1和擬南芥的9個(gè)HbBAM進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，HbBAM1和AtBAM1同源性最高，歸于一個(gè)亞類。應(yīng)用在線預(yù)測(cè)軟件ChloroP and TargetP[17-18]，ProtComp[19]通過(guò)分析HbBAM1編碼的氨基酸序列，其N末端有1條葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，HbBAM1定位于葉綠體中。

2.2 HbBAM1基因在不同組織和葉片不同發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，HbBAM1基因主要在巴西橡膠樹(shù)的雌花、雄花、葉片和種子中表達(dá)，在根中幾乎不表達(dá)（圖2）。HbBAM1基因在巴西橡膠樹(shù)不同發(fā)育時(shí)期葉片中的表達(dá)分析結(jié)果表明，隨葉片的發(fā)育進(jìn)程其表達(dá)量不斷增加，在淡綠期和穩(wěn)定期葉片中表達(dá)量最高（圖3）。在不同時(shí)間點(diǎn)葉片中的表達(dá)分析結(jié)果表明，HbBAM1基因在光合作用最強(qiáng)的上午10：00和下午16：00的表達(dá)量最大，而晚上20：00和22：00的表達(dá)量最小（圖4）。

2.3 HbBAM1在大腸桿菌中的重組表達(dá)

原核表達(dá)載體pGEX-4T-1的GST標(biāo)簽和pET43.1a的NusA標(biāo)簽均能促進(jìn)HbBAM1的可溶性表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，2種標(biāo)簽使得HbBAM1以可溶性表達(dá)（圖5）。酶活性分析結(jié)果表明，GST-HbBAM1和NusA-HbBAM1重組蛋白均有較強(qiáng)的β-淀粉酶活性（結(jié)果未顯示），因?yàn)镹usA-HbBAM1的表達(dá)量相對(duì)較大，最適酶活性溫度和抑制劑實(shí)驗(yàn)均使用該蛋白用于下一步的實(shí)驗(yàn)。HbBAM1的最適酶活性溫度是35 ℃，在45 ℃只有5.5%的酶活性，在50 ℃時(shí)則完全檢測(cè)不到酶活性（圖6）。不同濃度的氧化劑-氧化型谷胱甘肽和雙氧水均能抑制HbBAM1的酶活性，其中經(jīng)20 mmol/L的氧化型谷胱甘肽和0.2%的雙氧水處理，HbBAM1只有對(duì)照10%左右的酶活性（圖7）。

3 討論

HbBAM1的最適酶活性溫度為35 ℃，而在50 ℃時(shí)就完全沒(méi)有酶活性，與擬南芥的BAM1[10]和豌豆上胚軸中β-淀粉酶[20]的最適酶活性溫度類似。而與長(zhǎng)期淀粉儲(chǔ)存器官中的β-淀粉酶差異很大，它們的最適酶活溫度相對(duì)較高，大豆的β-淀粉酶為60 ℃[21]，甘薯的為53 ℃[22]，土豆的為55 ℃[23]。這可能與它們的細(xì)胞定位和功能不同有關(guān)。HbBAM1位于葉綠體，負(fù)責(zé)降解葉綠體內(nèi)臨時(shí)儲(chǔ)存的淀粉，最適酶活性溫度較低，如25 ℃時(shí)還有最大酶活性的71%，有利于在環(huán)境溫度條件下達(dá)到較大的酶活性，從而利于淀粉的快速降解，及時(shí)參與對(duì)環(huán)境變化的應(yīng)答。而大豆、土豆等長(zhǎng)期淀粉儲(chǔ)存器官中的β-淀粉酶最適酶活性溫度相對(duì)較高，低溫時(shí)的酶活性較低[21]，使得儲(chǔ)存器官中淀粉緩慢降解，有利于種子和塊莖中淀粉的長(zhǎng)期保存。

在擬南芥中，AtBAM1基因在幼嫩葉片中只在氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)，到成熟葉片時(shí)，葉肉細(xì)胞才也會(huì)有AtBAM1基因的表達(dá)。橡膠樹(shù)中HbBAM1基因也是隨著葉片的發(fā)育，在葉片中的表達(dá)量逐漸增大，很可能也是由于成熟葉肉細(xì)胞中HbBAM1基因大量表達(dá)，使得HbBAM基因在葉片中總體表達(dá)量增加。

橡膠樹(shù)HbBAM1的酶活性受到氧化型谷胱甘肽和雙氧水的抑制，這與擬南芥的AtBAM1[6，11]類似。擬南芥中光合系統(tǒng)I保持硫氧還蛋白的還原狀態(tài)，從而還原處于氧化狀態(tài)的AtBAM1，使得AtBAM1只能在白天處于激活狀態(tài)[11]。HbBAM1基因在白天的表達(dá)量明顯高于晚上，說(shuō)明HbBAM1主要在白天發(fā)揮其生物學(xué)功能。一天當(dāng)中上午10：00和下午16：00的光照強(qiáng)度適中，橡膠樹(shù)光合作用最強(qiáng)，這時(shí)HbBAM1基因的表達(dá)量也最高（圖4），HbBAM1可能在光照適宜的條件下，調(diào)控氣孔的打開(kāi)，促進(jìn)橡膠樹(shù)的光合作用。而在光照最強(qiáng)的中午12：00和14：00時(shí)，HbBAM1基因的表達(dá)量相對(duì)較低，減少氣孔的開(kāi)發(fā)，降低光合作用和減少水分的蒸發(fā)，使得橡膠樹(shù)能夠更好的適應(yīng)熱帶地區(qū)中午的高溫環(huán)境。HbBAM1基因在晚上的表達(dá)量最低，其在晚上處于本底表達(dá)水平。

本研究從橡膠樹(shù)中克隆了1個(gè)葉綠體型β-淀粉酶基因HbBAM1，確定了HbBAM1的最適酶活性溫度及不同氧化劑對(duì)其抑制作用，并分析了HbBAM1基因在不同組織和在葉片中同一天的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究其在橡膠樹(shù)葉片中的生理功能奠定了良好基礎(chǔ)。

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