紅菜薹離體再生體系的建立

王晨璐 陳龍正

摘要 [目的]為建立紅菜薹的離體再生體系，提高紅菜薹的生物技術(shù)育種效率。[方法]以紅菜薹帶柄子葉為外植體，選用TDZ、NAA兩種激素，進(jìn)行離體組織培養(yǎng)。[結(jié)果]以帶柄子葉在1/2MS+TDZ 3.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率達(dá)9.8%，以MS+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根效果最好。[結(jié)論]該研究為在生物技術(shù)育種層面上的研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 紅菜薹;離體再生;建立

中圖分類號(hào) S634文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2018）34-0030-03

菜薹（Brassica campestris L.）又名菜心，是蕓薹屬蕓薹種白菜亞種的菜薹變種[1]，原產(chǎn)于我國(guó)南部地區(qū)，是兩廣地區(qū)及海南、臺(tái)灣等地主要特菜之一。離體再生體系的建立在作物種質(zhì)創(chuàng)新中具有重要作用，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因編輯技術(shù)的日益發(fā)展，離體高效率的再生體系顯得尤為重要。但是，蔬菜作物的離體再生相對(duì)困難，因此建立一套簡(jiǎn)便實(shí)用的離體再生體系對(duì)種質(zhì)創(chuàng)新、生物技術(shù)育種具有重要意義。

許多研究者采用菜薹的帶柄子葉、原生質(zhì)體、游離小孢子等進(jìn)行培養(yǎng)，均取得了一定的成果[2-4]。張鵬等[5]研究認(rèn)為菜薹以子葉-子葉柄為外植體，不定芽誘導(dǎo)率最高。而何曉明等[6]則認(rèn)為菜薹再生能力在不同品種間差異很大，Zhang等[7]指出大白菜的基因型對(duì)它的再生能力影響極大，雖然一些菜薹品種已經(jīng)可以進(jìn)行再生，但是由于材料的專一性強(qiáng)，許多未研究過的品種在基因工程技術(shù)方面的應(yīng)用還是會(huì)受到限制。因此，筆者以未報(bào)道的紅菜薹為研究對(duì)象，以帶柄的子葉為外植體，探討TDZ、NAA等不同激素濃度對(duì)再生體系的影響，旨在為其在生物技術(shù)育種層面上的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 紅菜薹材料為TKD20170 種子由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。

1.2 無(wú)菌苗的獲取

將種子放到無(wú)菌水中浸泡15～20 min;取出種子，用75%的酒精處理40 s，無(wú)菌水沖洗3次;最后放到30%雙氧水中浸泡15 min，再用無(wú)菌水沖洗5次，無(wú)菌濾紙吸干表面水分等待播種。將種子接種于MS培養(yǎng)基中。25 ℃下黑暗中萌發(fā)2 d，然后移至16 h/d光照，3 000 lx 光強(qiáng)條件下培養(yǎng)。

1.3 分化培養(yǎng)

以5 d苗齡的幼苗為外植體材料。從中挑選健壯的幼苗，切取長(zhǎng)0.5 cm左右?guī)П尤~放入培養(yǎng)皿中，每個(gè)處理接種16～20個(gè)外植體。每個(gè)處理重復(fù)3次。接種后放置在25 ℃、2 500 lx光照強(qiáng)度、12 h/d光照時(shí)間的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。7 d后統(tǒng)計(jì)各處理的出芽數(shù)，計(jì)算分化率。

分化培養(yǎng)基：1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的TDZ、NAA等植物激素，形成不同的處理?xiàng)l件。T1～T9處理的激素添加的種類及用量見表1。

1.4 組培苗的生根培養(yǎng)

將外植體上分化出的不定芽剪切下來，轉(zhuǎn)到MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)。待組培苗生長(zhǎng)到5～6 cm，并且長(zhǎng)出2到3片幼葉時(shí)，將其分別轉(zhuǎn)到0、0.1、0.2 mg/L NAA濃度的生根培養(yǎng)基中，促不定根萌發(fā)。30 d后取出與CK（0 mg/L）進(jìn)行比較，篩選出合適的NAA濃度，用于誘導(dǎo)生根。

1.5 組培苗的移栽

組培苗接到生根培養(yǎng)基30～35 d后，待組培苗已長(zhǎng)出不定根，用流水沖洗凈組培苗根系上的培養(yǎng)基，將其栽入已滅菌的基質(zhì)中，其上覆蓋塑料膜，保持適合其生長(zhǎng)的溫度、濕度、光照，10 d左右移栽大田，10 d后觀察其成活與否。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅菜薹在不同激素配比的分化培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)效果

將帶柄子葉接到T1～T9處理的分化培養(yǎng)基中，7 d后分別觀察不同處理的幼苗誘導(dǎo)數(shù)。觀察發(fā)現(xiàn)T1～T5處理只有愈傷產(chǎn)生，并無(wú)芽點(diǎn)形成。T6～T9處理中部分帶柄子葉有不定芽產(chǎn)生（圖1）。

T6、T7、T8處理盡管可以分化出不定芽，但分化率很低。T6處理分化率為1.79%、T7處理的分化率為2%、T8處理的分化率為3.85%。T9處理分化率可達(dá)9.80%，表明T9處理激素比例是最佳配比（表2）。

2.2 紅菜薹生根培養(yǎng)基的選擇

將外植體分化獲得的芽接種到MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)（圖2A），10～20 d后可發(fā)育成小植株（圖2B）。獲得的無(wú)菌苗接到不同NAA濃度的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)（圖2C）。根據(jù)圖2D可知，含有0.2 mg/L NAA的培養(yǎng)基中長(zhǎng)出的根數(shù)目最多，根細(xì)長(zhǎng)、粗壯，植株生長(zhǎng)勢(shì)最好。因此，紅菜薹無(wú)菌苗以0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基誘導(dǎo)，最利于紅菜薹生根，并最終生長(zhǎng)成苗（圖2E）。

3 結(jié)論與討論

許會(huì)會(huì)等[4]對(duì)麻葉薹菜研究發(fā)現(xiàn)，最適培養(yǎng)基為MS+BA 5 mg/L+ZT 2 mg/L+NAA 0.7 mg/L，分化率為67.8%。在此基礎(chǔ)上，筆者嘗試了十幾種在菜薹、菜心、不結(jié)球白菜、大白菜上已經(jīng)報(bào)道的配方，這些配方在紅菜薹TKD201701上均未得到再生芽（數(shù)據(jù)未發(fā)表），推測(cè)這個(gè)紅菜薹基因型可能屬于頑拗型基因型。盡管比較難再生，但在該研究中，在培養(yǎng)基1/2MS+TDZ 3.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L上，紅菜薹仍然得到9.8%的分化率。在分化率統(tǒng)計(jì)上，許多研究利用再生的芽數(shù)/外植體數(shù)來計(jì)算，這樣比例很高。該研究利用試驗(yàn)中能夠再生不定芽的外植體數(shù)/總外植體數(shù)來計(jì)算，客觀的反應(yīng)一個(gè)基因型的難易程度。雖然，該研究中紅菜薹分化率不高，但是仍然為紅菜薹在基因工程方面的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

在誘導(dǎo)菜薹不定芽分化的培養(yǎng)基上，盡管T1處理與T7處理、T2與T8處理、T3與T9處理的培養(yǎng)基都添加了等量的硝酸銀與萘乙酸，但是T1、T2、T3生理培養(yǎng)基上卻沒有芽再生，由此可見TDZ在芽的再生上起較大的作用。而隨著TDZ濃度的升高，再生率也變高，這同樣驗(yàn)證了TDZ的重要性。低濃度的TDZ培養(yǎng)基中，不同濃度的NAA并不能起到提高再生率的作用。但是在高濃度TDZ培養(yǎng)基上，隨著NAA濃度的提高，其芽再生率也在變高。由此可見TDZ、NAA在誘導(dǎo)菜薹帶柄子葉的再生上都起到了一定的作用，但是TDZ的作用更關(guān)鍵。

參考文獻(xiàn)

[1]李曙軒，李樹德，蔣先明，等.中國(guó)農(nóng)業(yè)百科全書·蔬菜卷[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1990：33-34.

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[6]何曉明，潘瑞熾.薹菜組織培養(yǎng)和植株再生研究[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，200 17（2）：34-40.

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