柱后基體分離—高效液相色譜質譜法測定煙草中香味成分

田振鋒 馬麗伊 孔俊

摘要 [目的]提取煙草中的香味成分，并用LC-MS/MS方法對其進行測定和分析。[方法]煙草樣品經甲醇溶液超聲萃取后，取上清液直接進樣LC-MS/MS分析，采用電噴霧正離子多反應監(jiān)測方式檢測，并采用柱后預分離糖基體，消除其對香味成分離子化的影響。[結果]各香味成分線性關系良好（R2≥ 0.982 2），加標回收率為82.43% ～ 95.77%，平均相對標準偏差（RSD）為2.00%～ 4.58%。[結論]該方法靈敏、準確，分析速度快，適合煙草中香味成分檢測。

關鍵詞 煙草；香味成分；LC-MS/MS；超聲提取

中圖分類號 TS424 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）21-0178-04

Abstract [Objective]Aroma components in tobacco were extracted and assayed and analyzed by LCMS/MS method.[Method]After the tobacco sample was extracted by the methanol solution， the supernatant was directly analyzed by LCMS/MS. Electrospray positive ion multiple reaction monitoring was used to detect and use the postcolumn preseparation of the sugar matrix to eliminate its effect on the ionization of aroma components.[Result]The linear relationship of the flavor components was good （R2≥0.982 2）， the spike recovery was 82.43%-95.77%， and the average relative standard deviation （RSD） was 2.00%-4.58%.[Conclusion]The method is sensitive， accurate and analysis speed fast，which is suitable for the detection of aroma components in tobacco.

Key words Tobacco；Aroma components；LCMS/MS；Ultrasound extraction

香味成分對煙葉品質具有決定性作用，是衡量煙葉質量的重要指標[1]。煙草中香味物質種類多、含量少，需要采用合適的前處理方法和靈敏的分析測試手段[2]。常用測定方法是樣品經預處理后，GC-MS定性定量分析[3-4]。主要預處理方法有溶劑萃?。⊿E）[5]和同時蒸餾萃?。⊿DE）[6]等方法。SE 法是一種常用提取煙草香味物質的方法，但共存基體成分復雜，影響香味成分的準確定量。SDE法集提取、蒸餾和萃取于一身，是目前煙草香味成分測定的常用預處理方法，但由于該方法需高溫蒸餾，易引起煙草中糖類和氨基酸發(fā)生梅拉德（Maillard）反應，生成香味成分，影響煙草中的糠醛、呋喃類等焦甜香香味成分的測定，使得測定結果與煙草實際含量存在偏差。LC-MS/MS法[7-8]可直接分析樣品提取液中香味成分。但樣品提取液中含有大量糖基體，影響香味成分的質譜定量。

筆者利用糖基體的色譜保留時間小于香味成分，在柱后分離糖基體，避免其進入質譜儀，消除糖基體對香味成分離子化的影響，旨在建立LC-MS/MS方法定量測定煙草中香味成分。

1 材料與方法

1.1 試材

烤煙（云煙100）；二氯甲烷、甲醇、乙酸銨、乙腈（色譜純，美國Tedia試劑公司）；一次性針頭過濾器（0.22 μm有機系，國藥集團化學試劑有限公司）。5種香味物質標樣：β-紫羅蘭酮、甲基環(huán)戊烯醇酮、γ-丁內酯、2-乙酰呋喃、4-羥基-2，5-二甲基呋喃酮（純度均大于98%，英國Alfa Aesar 公司）。

1.2 儀器

Waters Acquity 高效液相色譜儀（美國Waters公司）；AL204-IC型電子分析天平（感量0.000 1 g，瑞士 Mettler Toledo 公司）；API 4000 QTRAP質譜儀（美國應用生物系統(tǒng)公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）。

1.3 標準溶液的配制

分別準確稱取香味物質標樣各0.2 g，用甲醇配制成20 μg/mL的標準儲備溶液，逐步稀釋成不同濃度標準工作溶液。

1.4 樣品處理與分析

使用0.3 μg/mL各物質標準溶液對色譜和質譜條件進行優(yōu)化，方法優(yōu)化完成后，再對樣品前處理過程進行優(yōu)化（超聲輔助溫度和時間、萃取溶劑），最后采用基體柱切換技術進樣分析。

準確稱取1 g煙末于50 mL錐形瓶中，加入20 mL甲醇，在室溫下超聲萃取30 min，轉移至50 mL離心管中，3 000 r/min下離心5 min，取上清液經0.22 μm有機系濾膜過濾后LC-MS/MS分析。

1.5 色譜質譜分析條件

色譜柱：Nova-Pak C18色譜柱（4 μm，3.9 mm×150 mm，美國Waters公司）；流動相：A相為0.1%乙酸銨水溶液，B相為甲醇；流速0.4 mL/min。梯度洗脫條件：0 min，100% A；8 min，70% A；16 min，40% A；24 min，20% A；30 min，0% A；35 min，100% A；40 min，100% A。柱溫20 ℃，進樣量5 μL。

質譜電噴霧正離子模式（ESI+），電噴霧電壓4 500 V，離子源溫度500 ℃；離子源輔助氣1：275.79 kPa，離子源輔助氣2：275.79 kPa。

2 結果與分析

2.1 LC-MS/MS方法優(yōu)化

2.1.1 色譜條件優(yōu)化。

分別以水或0.1%乙酸銨水溶液為流動相A，以乙腈或甲醇為流動相B，研究在不同洗脫梯度下測定2 μg/mL混合標準樣品的分離效果。結果表明，當流動相A為0.1%乙酸銨水溶液，流動相B為甲醇，洗脫條件為0 min，100% A；8 min，70% A；16 min，40% A；24 min，20% A；30 min，0% A；35 min，100% A；40 min，100% A時各化合物可完全分離。

2.1.2 質譜條件優(yōu)化。

采用ESI源自動注射泵進樣手動優(yōu)化多反應監(jiān)測掃描（MRM）定量方法。連續(xù)注射300 ng/mL各種物質標準溶液進行Q1全掃描確定母離子，采用Q2碎片離子掃描確定子離子，然后依次優(yōu)化去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE），以提高靈敏度使得信號穩(wěn)定。最終選定定量離子對和最佳質譜檢測條件見表1。

2.2 前處理條件優(yōu)化

2.2.1 萃取溶劑的選擇。

分別研究甲醇、乙醇、乙腈作為提取試劑對香味物質提取效率的影響，結果如圖1所示。由圖1可知，乙醇提取效率最低，乙腈次之，甲醇提取效率最高，因此選擇甲醇作為香味成分的提取試劑。

2.2.2 萃取條件的選擇。

以甲醇為提取劑，考察了超聲輔助萃取的溫度和時間對提取效率的影響。結果表明，萃取溫度（20～50 ℃）對提取效果影響不大，且溫度過高對香味物質會產生影響。提取效率隨著時間延長而增加（圖2），當萃取時間到達30 min時，提取效率最高，之后無明顯變化。因此，選擇萃取溫度和時間分別為20 ℃和30 min。

2.3 工作曲線、檢測限和定量限

準確配制系列混合標準溶液，按照“2.1”優(yōu)化后的條件進行定量分析，以各標樣成分峰面積（y）對相應的濃度（x，ng/L）進行線性回歸分析，得到標準曲線方程、線性范圍及決定系數（表2）。由表2可知，各目標化合物相關性良好，適合定量分析。

2.4 樣品分析

在上述優(yōu)化條件下對同一煙草樣品平行測定6次，結果見表3。將一定量的混合標樣加到煙草樣品中，加標樣品和未加標樣品平行進行前處理和定量分析。由表3可知，加標回收率為82.43%～95.77%，RSD為2.00%～4.58%。

2.5 基質效應

采用甲醇提取煙草中香味物質成分LC-MS/MS定量，具有操作簡便、環(huán)境友好等優(yōu)點，但此法一個顯著缺點是存在基體干擾，基體中的干擾組分在電噴霧液滴表面離子化過程中與待測組分產生競爭，從而影響了電噴霧的離子化效率，即待測組分離子化效率與進入電噴霧離子源的基體有密切關系。如圖3可見，香味物質信號隨葡萄糖增加而顯著下降。

從葡萄糖和各香味物質選擇離子流色譜圖（圖4）可以看出，葡萄糖保留時間在5 min之前，而各香味成分保留時間在10 min之后，因此可以利用保留時間的不同，對干擾成分和目標成分進行分離處理。

圖5所示的是樣品經甲醇超聲提取后直接進樣分析結果，葡萄糖對待測組分信號產生極大的干擾，γ-丁內酯和4-羥基-2，5-二甲基呋喃酮基線升高，β-紫羅蘭酮、2-乙酰呋喃、甲基環(huán)戊烯醇酮信號較弱且雜峰較多。該研究根據葡萄糖和香味成分保留時間差值較大，采用基體柱后分離技術，在2 min時使用切換閥把糖分切入廢液瓶，向質譜里通入甲醇溶劑，5 min時把切換閥切回至原來位置，使香味成分進入質譜進行測定，這樣可消除糖引起的基質效應，結果如圖6所示，待測組分信號顯著增強。

3 結論

該研究利用糖基體的色譜保留時間小于香味成分，建立了基體柱切換-高效液相色譜串聯(lián)質譜法直接測定煙草中弱極性香味成分方法。該方法可以有效消除香味成分測定過程中的假陽性問題，消除了基質抑制的現象，并免除了樣品衍生化處理過程，具有前處理過程簡單、省時和重復性好且靈敏度高等優(yōu)點，適用于煙草中香味成分的快速、準確測定。

參考文獻

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