海帶多糖LJP61A對動脈粥樣硬化的調(diào)控機制研究

陳浩然

摘要 [目的]探討海帶多糖LJP61A對動脈粥樣硬化的調(diào)控作用。[方法]采用高脂飲食誘導(dǎo)LDLr-/-小鼠動脈粥樣硬化模型，用海帶多糖LJP61A進行灌胃，觀察其對動脈粥樣硬化的調(diào)控機制。[結(jié)果]LJP61A可以緩解動脈粥樣硬化引起的血管斑塊形成，并下調(diào)血管炎癥。隨著海帶多糖添加量的增加，抗動脈粥樣硬化作用增強。[結(jié)論]海帶多糖LJP61A可以通過減輕血管炎癥來發(fā)揮干預(yù)動脈粥樣硬化形成機制。

關(guān)鍵詞 海帶多糖；動脈粥樣硬化；調(diào)控機制

中圖分類號 R543.5 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）21-0158-04

Abstract [Objective] To discuss the regulation mechanism of laminarin LJP61A on atherosclerosis. [Method] LDLr-/- mouse atherosclerosis model was induced by highfat diet. Mice was fed with Laminarin LJP61A by intragastric administration.The regulation mechanism of laminarin LJP61A on atherosclerosis was observed. [Result] LJP61A could relieve atherosclerotic plaque formation and reduce vascular inflammation. With the increase of laminarin dose， antiatherosclerosis strengthened.[Conclusion]LJP61A could play a role in the regulation mechanism of atherosclerosis by reducing blood vessel inflammation.

Key words Laminarin；Atherosclerosis；Regulation mechanism

動脈粥樣硬化主要是由于機體脂質(zhì)代謝發(fā)生障礙而引起的局部或全身性血管病變[1]。動脈粥樣硬化形成的主要機制是由于大量炎癥的誘導(dǎo)，此過程中多種免疫細胞參與其中[2]。

海帶屬于褐藻類植物，呈扁平帶狀，最長可達到20 m，因其多產(chǎn)及獨特的口感已被廣泛用作烹飪食材。研究表明，海帶多糖LJP61A能夠通過減緩主動脈血管鈣化來干預(yù)腎衰竭的進程，并且海帶多糖還具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂等作用[3-11]。筆者探討了海帶多糖LJP61A緩解動脈粥樣硬化的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

研究對象。新鮮海帶頭購自安徽省合肥市包河區(qū)家樂福超市； LDLr-/-小鼠由合肥工業(yè)大學(xué)動物實驗中心提供。

1.1.2

主要試劑。ELISA試劑盒購自源葉生物公司；油紅O染色液購自索萊寶公司；蘇木素購自索萊寶公司；辛伐他汀購自杭州默沙東制藥有限公司。

1.1.3

主要儀器。磁力攪拌器由德國IKA公司生產(chǎn)；紫外分光度計購自上海美浦達公司。

1.2 方法

1.2.1

海帶多糖的提取。海帶多糖（LJP61A）經(jīng)過清洗曬干后磨粉，然后通過水提醇沉得到醇提物，經(jīng)脫蛋白透析后得到粗多糖，再經(jīng)DEAE和S500離子交換樹脂過濾得到單一組分LJP61A[12-13]。

1.2.2 飼喂試驗。將LDLr-/-雄性小鼠（7周齡）在SPF級動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，將小鼠隨機分為5個組別，每組16只，分別為正常對照組（普通低脂日糧，LFD）、模型組（高脂日糧，HFD）、低劑量海帶多糖組[高脂日糧+LJP61A 50 mg/（kg·d）]、高劑量海帶多糖組[高脂日糧+LJP61A 200 mg/（kg·d）]及陽性對照組[0.014 g/（kg·d）辛伐他汀，SIM]。正常對照組小鼠飼喂普通低脂日糧，購自安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。高脂日糧配方參考文獻[14]。連續(xù)喂養(yǎng)14周，每周測量各組小鼠的體重，14周后禁食過夜，用CO2處死。取一半腎臟置于PBS緩沖液中，于-4 ℃下保存；將另一半腎臟浸泡于4%多聚甲醛中。

1.2.3

血管的油紅O染色。將主動脈根部的血管標本從4%的多聚甲醛固定液中取出，漂洗剝膜。取60 mL儲備液，加入蒸餾水至100 mL，染色。最后用蒸餾水浸泡標本，將處理好的血管腔展開，并固定形態(tài)，使用Image-Pro Plus Version 6.0軟件分析計算斑塊面積。

1.2.4

主動脈弓HE染色。將主動脈弓的石蠟切片分別置于100%的二甲苯和二甲苯與乙醇（按1∶1混合）溶液中15 min脫蠟；脫蠟后的切片分別用100%乙醇溶液、95%乙醇溶液、75%乙醇溶液脫水1 min，再用95%乙醇溶液、100%乙醇脫水；松節(jié)油浸入后，烘干封片。

1.2.5

巨噬細胞CD68的免疫組化。利用二步法免疫組織化學(xué)檢測系統(tǒng)，將石蠟包埋的切片置于60 ℃烘箱中烤片1 h，用二甲苯、酒精脫蠟后依次用自來水沖洗2 min，放入去離子水使用搖床振蕩清洗，重復(fù)2次，用滅菌生理鹽水（0.01 mol/L）持續(xù)沖洗5 min，重復(fù)3次。將切片放入室溫下的0.01 mol/L檸檬酸鹽修復(fù)液中置于微波爐80 ℃加熱5 min，然后40 ℃低火持續(xù)15 min，取出室溫下自然冷卻，在搖床上使用PBS緩沖液清洗1次。加入3%的H2O2 去離子水室溫孵育10 min消除內(nèi)源性過氧化物酶，使用PBS緩沖液清洗3次后加入血清稀釋的一抗CD68（37 ℃孵育2 h或4 ℃孵育過夜），取出后加入即用型Polymer Helper和即用型Polyperoxidase-anti-mouse IgG 20 min，并用PBS緩沖液沖洗3次后加入DAB顯色液。

1.2.6

ELISA檢測動脈粥樣硬化血管中炎性因子的水平。按照ELISA試劑盒操作步驟測定TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

1.2.7

熒光定量PCR檢測動脈粥樣硬化血管中炎性因子mRNA的表達。精確稱量小鼠血管組織100 mg，用滅菌消毒的手術(shù)剪在冰上充分均勻剪碎后，放入1 mL勻漿器中，各加入TRlzol 1 mL于冰上充分研磨，將組織勻漿液轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中室溫下靜置5 min，放入低溫高速離心機下（4 ℃，12 000 r/min）離心5 min，轉(zhuǎn)移上清至新的EP管中，加入氯仿200 μL，連續(xù)振蕩15 s，使其充分混勻，在室溫下靜置10 min。然后，放入低溫高速離心機下（4 ℃，12 000 r/min）離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的EP管中。加入異丙醇500 μL，輕輕搖晃管中液體，室溫下靜置10 min，管底出現(xiàn)乳白色膠狀沉淀，即為RNA。最后，使用低溫高速離心機（4 ℃，12 000 r/min）離心10 min，吸掉上清。各加入1 mL乙醇（75%）清洗沉淀物，輕輕搖晃漂洗，8 000 r/min離心5 min，保留沉淀并在室溫下將EP管倒置于濾紙上晾干，分別加入DEPC 20 μL水使RNA溶解，充分振蕩混勻。用移液槍吸取RNA溶液1 μL，使用Nanodrop 2000 Spectrophptpmeter儀器測定RNA濃度及相對吸光度（A260/A280），以判定提取的RNA是否達標。最后，進行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增。定量PCR引物見表1。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS統(tǒng)計軟件進行處理。結(jié)果均以±SD表示，用方差分析進行顯著性比較。*表示與正常對照組差異顯著（P<0.05）；**表示與正常對照組差異極顯著（P<0.01）；#表示與模型組差異顯著（P<0.05）；##表示與模型組差異極顯著（P<0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 主動脈的油紅O染色

各組小鼠主動脈的油紅O染色結(jié)果如圖1所示。從圖2可以看出，與正常對照組相比，模型組動脈粥樣硬化面積占總面積的比例極顯著增加（P<0.01）。高劑量海帶多糖組、低劑量海帶多糖組與陽性對照組動脈粥樣硬化面積占總面積的比例均顯著低于模型組。隨著海帶多糖LJP61A添加量的增加，動脈粥樣斑塊的面積越小。

2.2 主動脈弓HE染色

從圖3可以看出，模型組小鼠血管內(nèi)壁有明顯的脂塊堆積，而低劑量海帶多糖組和高劑量海帶多糖組血管內(nèi)壁脂塊堆積程度明顯降低。

2.3 巨噬細胞CD68的免疫組化染色

從圖4可以看出，正常對照組小鼠主動脈中巨噬細胞的CD68表達穩(wěn)定，而模型組巨噬細胞的CD68明顯增多，低劑量海帶多糖組和高劑量海帶多糖組CD68陽性表達顯著減少。

2.4 LJP61A對小鼠血管炎性因子含量的影響

從圖5可以看出，模型組小鼠血管內(nèi)的TNF-α、IL-1β和IL-6大量增加；低劑量海帶多糖組和高劑量海帶多糖組TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯降低，且隨著LJP61A添加量的增加，TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯降低。這表明海帶多糖LJP61A能夠顯著抑制炎性因子的增加。

2.5 LJP61A對血管中炎性因子mRNA表達的影響

由圖6可知，與模型組相比，海帶多糖LJP61A干預(yù)組能明顯下調(diào)TNF-α、IL-6的表達，且隨著LJP61A添加量的增加，下調(diào)作用越明顯。

3 討論

臨床研究表明，動脈粥樣硬化的進展最終導(dǎo)致易損斑塊的發(fā)展，這可能增加心血管事件的風(fēng)險。血管壁中活性氧的增加或減少是動脈粥樣硬化的主要原因。動脈粥樣硬化易發(fā)區(qū)的血管滋養(yǎng)層密度較高，是動脈粥樣硬化形成的早期事件，此外，編碼VEGF的腺病毒的外膜遞送引發(fā)新血管的生成和內(nèi)膜增生，而血管生成抑制劑減弱斑塊生長。在人體內(nèi)，伴有出血的斑塊內(nèi)血管的生成主要與薄壁動脈粥樣硬化，巨噬細胞浸潤與大的壞死核心（即脆弱斑塊）有關(guān)。斑塊新生血管通常是滲漏的，因此可能會釋放斑塊內(nèi)紅血球（出血）。此外，動脈粥樣硬化病變誘發(fā)的壁內(nèi)出血與紅細胞碎片增多、鐵沉積、泡沫細胞和膽固醇晶體形成有關(guān)。

血管生成過程可以由缺氧誘導(dǎo)的表達和血管生成因子釋放（例如VEGF）直至氧量正?；謴?fù)。在動脈粥樣硬化斑塊中，由于內(nèi)膜增厚和炎癥，動脈腔內(nèi)的局部O2擴散可能不足。缺氧和炎癥狀態(tài)促進血管生成和炎癥因子的釋放，這些因子刺激從血管滋養(yǎng)血管發(fā)芽血管生成。這種新血管可以提供營養(yǎng)，并促進巨噬細胞浸潤，血管壁增厚，脂質(zhì)沉積，炎癥和動脈粥樣硬化病變進展。因此，動脈粥樣硬化斑塊小鼠具有較高的炎性細胞浸潤。

平滑肌含量使纖維帽變薄和斑塊內(nèi)出血。另外，斑塊肩區(qū)域在內(nèi)膜平滑肌細胞和纖維帽膠原中有較高水平的鈣蛋白酶-2、半胱天冬酶-3和基質(zhì)金屬蛋白酶-2。海帶多糖LJP61A可能是抗炎相關(guān)和氧化應(yīng)激相關(guān)動脈粥樣硬化并發(fā)癥的可行治療策略。動脈粥樣硬化是以大量膽固醇和非分解性炎癥為特征的中大動脈血管壁的多灶性改變。動脈粥樣硬化病變中的新血管形成在斑塊生長和不穩(wěn)定性中起主要作用。血管生成過程由經(jīng)典血管生成因子和特異于動脈粥樣硬化血管生成的其他因子介導(dǎo)。除了在斑塊進展中的作用外，新血管形成可能參與斑塊不穩(wěn)定和血栓栓塞事件。在各種動物模型中，抗血管生成劑對于減輕動脈粥樣硬化是有效的。動脈粥樣硬化斑塊的變化特征在于從病理內(nèi)膜增厚進展到纖維粥樣瘤薄帽纖維粥樣瘤[15]，并最終到斑塊破裂和血栓形成。這些斑塊通常被描述為不穩(wěn)定或易損斑塊，其特征在于巨大的壞死核心和變薄的纖維帽，其被巨噬細胞和淋巴細胞浸潤并且缺乏或少量平滑肌細胞。目前動脈粥樣硬化斑塊的病理生理學(xué)已被廣泛研究[16-17]。然而，斑塊進展的分子機制和斑塊破裂的觸發(fā)因素尚不確定。該研究結(jié)果表明，CD68表達增加了巨噬細胞的內(nèi)皮下堆積，這在動脈粥樣硬化進展期間在巨噬細胞浸潤或增殖或自身抗體形成方面具有廣闊的病理意義[18-19]，而海帶多糖LJP61A能夠通過降低炎性因子的表達和聚集來緩解血管動脈粥樣硬化的形成。

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