白骨壤葉中生物堿的提取及抗氧化活性研究

夏遠(yuǎn)濤　韋瑩華　高雅廷　孫會杰　唐玉　方笛　覃丹娜　周桂

摘要 [目的]確定白骨壤葉中生物堿的提取工藝和初步鑒定該物質(zhì)的活性。[方法]以生物堿的提取得率為評價指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法，優(yōu)選超聲提取白骨壤中生物堿的工藝，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時間、超聲提取溫度和溶液pH對提取工藝的影響。采用硫酸亞鐵-水楊酸法、DPPH反應(yīng)法比較體外清除自由基作用，測定白骨壤葉中總生物堿的抗氧化活性。[結(jié)果]影響白骨壤葉中生物堿提取率的主要因素是提取溶液pH，最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時間20 min、提取溫度70 ℃、提取溶液pH=3。優(yōu)選之后的提取工藝最佳得率為14.12%，方便快捷可行、穩(wěn)定性好。清除自由基的強(qiáng)弱為DPPH自由基大于羥基自由基。[結(jié)論]該研究為生物堿的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 白骨壤葉；生物堿；提取工藝；正交試驗(yàn)；抗氧化活性

中圖分類號 R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）17-0006-03

Abstract [Objective]The research aimed to determine the extraction process of alkaloids in the leaves of Avicennia marina and the preliminary identification of the activity of the substance. [Method]Taking the extraction rate of alkaloids as the evaluation index，orthogonal experiment was used to optimize the ultrasonic extraction of alkaloids from Avicennia marina. The effects of ethanol volume fraction， ultrasonic extraction time， ultrasonic extraction temperature and solution pH on extraction process were investigated.The antioxidant activity of total alkaloids in Avicennia marina was determined by the method of ferrous sulfatesalicylic acid oxidation， DPPH reaction in vitro.[Result]The main factor affecting the extraction rate of alkaloids in Avicennia marina leaves was the pH of the extraction solution.The optimal extraction conditions were ethanol concentration 70%， extraction time 20 min， extraction temperature 70 ℃， extraction solution pH = 3.The optimum extraction rate after optimization was 14.12%， which was convenient， feasible and stable. The order of scavenging free radicals was DPPH radical> hydroxyl radical.[Conclusion]The study provides a theoretical basis for the application of alkaloids.

Key words Aricennia marina leaves；Alkaloids；Extraction process；Orthogonal test；Antioxidant activity

白骨壤（Aricennia marina）又名海欖雌，是馬鞭草科紅樹植物，生長于高鹽度的海岸潮間帶[1]，具有紅樹先鋒樹種稱號。作為廣西北部灣的民間傳統(tǒng)藥食同源植物，白骨壤具有抗癌、收斂止血、斂肺止咳、澀腸止瀉等功效[2]，常用于醫(yī)治膿腫、出血、腹瀉、蛇蟲咬傷、潰瘍、瘧疾等疾病。此外，白骨壤在沿海地區(qū)被俗稱為欖錢，用作海鮮烹飪的配菜，具有降火解暑功效的“車螺欖錢湯”是熱帶沿海一帶居民美味爽口的佳肴之一。在海南等地區(qū)，海桑和水耶的果實(shí)可以直接生吃，也可加工制作成飲料或調(diào)味品等[3]。目前只見對白骨壤果實(shí)中生物堿的研究[4]和果實(shí)中抗氧化活性成分研究的報(bào)道[5]，但有關(guān)白骨壤葉中生物堿的研究及其抗氧化活性方面的研究鮮見報(bào)道。筆者以白骨壤葉為材料，對其中生物堿成分提取，采用正交試驗(yàn)法進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，通過研究篩選出最佳提取工藝條件，并通過DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子這3個指標(biāo)的測定結(jié)果與分析來探究白骨壤葉中生物堿的抗氧化活性，為紅樹植物的藥用價值研究提供理論依據(jù)，也為天然抗氧化劑的應(yīng)用研究提供來源和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑。

白骨壤葉采自廣西北海紅樹林生態(tài)自然保護(hù)區(qū)，并于廣西高校微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-20 ℃冰箱凍存。

1.1.2 試劑?？鄥A、DPPH、水楊酸、過氧化氫、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、乙醇、甲醇、NaOH、葡聚糖凝膠LH-20（SephadexLH-20）、鹽酸、石油醚、氫溴酸、鉬硫酸、濃硫酸、濃硝酸、碘化汞鉀、碘-碘化鉀，均為分析純。

1.1.3 儀器。

DHG-914電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；SS230-A多功能攪拌機(jī)；UV-1201紫外可見分光光度計(jì)；AL104電子天平；JYT-2架盤藥物天平；GM-0.33H隔膜真空泵；Fs-450型超聲儀器；CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀；真空干燥器。

1.2 方法

1.2.1 總生物堿含量的測定。

1.2.1.1 苦參堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。按照文獻(xiàn)[6]的方法于波長410 nm處測定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=0.086 1C-0.030 3（R2=0.999 5）。

1.2.1.2 白骨壤葉中總生物堿含量測定。取白骨壤葉粉末1 g，同“1.2.1.1”標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測定吸光度，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇做參比。

白骨壤葉中總生物堿提取率=[（C×N）/W×106]×V0×100%，

式中，C為樣液濃度（μg/mL）；V0為樣液定容后的體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)；W為稱取樣品白骨壤葉粉質(zhì)量（g）。

1.2.2 白骨壤葉中總生物堿提取單因素試驗(yàn)。

提取工藝流程參照文獻(xiàn)[7-9]，并做部分改動，準(zhǔn)確稱取白骨壤葉粉末1 g，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇提取劑，超聲功率為250 W進(jìn)行提取，過濾后得生物堿粗提物溶液，用石油醚除色素再次萃取，測定吸光度，計(jì)算提取率。

1.2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇。采用體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液40 mL作為溶劑，在上述基本提取工藝條件下進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2.2 超聲提取時間的選擇。超聲提取時間分別為10、15、20、25、30 min，在上述基本提取工藝條件下進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2.3 超聲提取溫度的選擇。溫度55、60、65、70、75 ℃，在上述基本提取工藝條件下進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2.4 溶液pH的選擇。在溶液pH分別為1、2、3、4、5（用濃氯化氫調(diào)節(jié)）的條件下進(jìn)行超聲提取，在上述基本提取工藝條件下進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.3 白骨壤葉中總生物堿提取正交試驗(yàn)。

根據(jù)白骨壤葉中總生物堿提取單因素所確定的試驗(yàn)范圍，從中挑出對白骨壤葉中總生物堿提取得率影響大的因素，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定提取的最佳工藝條件，每個試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 提取物的顏色反應(yīng)。

1.2.4.1 碘化鉍鉀試驗(yàn)。準(zhǔn)確吸取0.5 mL乙醇提取液，向其中加入2滴改良碘化鉍鉀試劑。

1.2.4.2 碘化汞鉀試驗(yàn)。準(zhǔn)確吸取0.5 mL乙醇提取液，向其中加入2滴碘化汞鉀試劑。

1.2.4.3 碘-碘化鉀試驗(yàn)。準(zhǔn)確吸取0.5 mL乙醇提取液，向其中加入2滴碘-碘化鉀試劑。

1.2.5 白骨壤葉中總生物堿抗氧化活性試驗(yàn)。

1.2.5.1 總生物堿清除DPPH自由基的能力測定。將白骨壤葉中總生物堿粗提物用超純水稀釋到濃度為10、20、30、40、50 μg/mL的溶液，冷藏備用，設(shè)空白組（DPPH無水乙醇溶液+2 mL超純水）、試樣組（DPPH無水乙醇溶液+2 mL不同質(zhì)量濃度試樣溶液）和參比組（無水乙醇溶液+2 mL不同質(zhì)量濃度試樣溶液），加樣后暗處放置60 min，在波長517 nm處測定吸光度，VC為陽性對照。

DPPH自由基清除率=[A0-（Ax-Ax0）]/A0×100%

式中，A0為空白組吸光度，Ax為試樣組吸光度，Ax0為參比組吸光度。

1.2.5.2 總生物堿清除羥基自由基（·OH）的能力測定[10]。將白骨壤葉中總生物堿粗提物用超純水稀釋到濃度為10、20、30、40、50 μg/mL的溶液，冷藏備用，采用硫酸亞鐵-水楊酸法進(jìn)行測定。對羥基自由基的清除率（E）按下式計(jì)算：

E=[A0-（Am-An）]/A0×100%

式中，A0為空白對照液的吸光度，Am為加入生物堿后的吸光度，An為不加H2O2時生物堿的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度的選擇。

由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，生物堿的提取效果增強(qiáng)，乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時，生物堿的提取率為3.89%，乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%時，提取率趨于穩(wěn)定，但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增大，生物堿的提取率反而下降?？紤]到提取效率，因此選定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、70%、80%作為正交試驗(yàn)的3個水平。

2.1.2 超聲提取時間的選擇。

由圖2可知，在10～20 min時，隨著提取時間的增大，提取率增高，在20 min時達(dá)到最大，最大提取率為13.74%；但20 min之后，提取時間越長，生物堿提取率下降。考慮到可能是由于白骨壤葉中生物堿含有對熱不穩(wěn)定的成分，在長時間加熱過程中會被破壞或分解，因此選定提取時間10、15、20 min作為正交試驗(yàn)的3個水平。

2.1.3 超聲提取溫度的選擇。

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，生物堿的提取率不斷升高，在溫度為70 ℃時，達(dá)到最大，最大提取率為14.74%；在70 ℃之后，隨著溫度的繼續(xù)升高，提取率呈下降趨勢。因此提取溫度控制在70 ℃左右較為適宜，選取65、70、75 ℃作為正交試驗(yàn)的3個水平。

2.1.4 溶液pH的選擇。

由圖4可知，在pH為1～2時，隨著酸性的變?nèi)酰飰A提取率降低；在pH為2～3時，隨著酸性的變?nèi)?，提取率又再次升高，并在pH=3時達(dá)到最大；而后隨著酸性的變?nèi)?，提取率不斷降低?？紤]到可能是由于白骨壤葉中生物堿含有與酸發(fā)生作用的成分，在pH=3時生物堿較為穩(wěn)定，因此選定溶液pH 1、2、3作為正交試驗(yàn)的3個水平。

2.2 正交試驗(yàn)

采用L9（34）正交表（表1），乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲提取時間（B）、超聲提取溫度（C）、溶液pH（D）作為4個考察因素，選取3個水平進(jìn)行正交試驗(yàn)[7]。

由表2可知，RD>RC>RB>RA，4個因素對白骨壤中生物堿提取率的影響從大到小依次為溶液pH（D）、提取溫度（C）、提取時間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（A），最優(yōu)組合A2B3C2D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、提取時間為 20 min、提取溫度 70 ℃、提取溶液pH=3。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按最優(yōu)組合A2B3C2D3條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)白骨壤葉中生物堿提取率平均值為14.12%，高于表2中每一項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果，故A2B3C2D3為最優(yōu)提取工藝。

2.4 顏色反應(yīng)試驗(yàn)

碘化鉍鉀試驗(yàn)立刻出現(xiàn)磚紅色的沉淀；碘化汞鉀試驗(yàn)立刻出現(xiàn)淺黃色沉淀；碘-碘化鉀試驗(yàn)立刻出現(xiàn)棕色沉淀。3種顏色反應(yīng)表明提取的物質(zhì)含有生物堿類化合物。

2.5 白骨壤葉中總生物堿抗氧化活性試驗(yàn)

2.5.1 清除DPPH試驗(yàn)。

由圖5可知，在一定范圍內(nèi)，白骨壤葉中總生物堿提取物和VC對DPPH自由基清除率均逐漸增強(qiáng)，說明白骨壤葉中總生物堿和VC對DPPH自由基的清除能力存在著一定的量效關(guān)系。在相同質(zhì)量濃度下，白骨壤葉中總生物堿提取物對DPPH自由基具有較好的清除作用，白骨壤葉中總生物堿清除效果顯示略低于VC對DPPH自由基的清除能力。

2.5.2 清除羥基自由基試驗(yàn)。

由圖6可知，在一定范圍內(nèi)，白骨壤葉中總生物堿提取物對羥基自由基清除率均逐漸增強(qiáng)，但隨著濃度的逐漸增大，清除效果趨于平緩，說明白骨壤葉中總生物堿和Vc對羥基自由基的清除能力存在著一定的量效關(guān)系。在相同質(zhì)量濃度下，總生物堿的清除效果明顯高于VC。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選得出白骨壤葉中生物堿最佳提取工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、提取時間為 20 min、提取溫度 70 ℃、提取溶液pH=3，在此工藝條件下，得到白骨壤葉中生物堿提取率為14.12%。利用超聲波提取方法，可以極大地縮短提取時間，且能達(dá)到較高的提取效率。因此，超聲波提取法是一種較為理想的提取方法，具有省時、高效、節(jié)能的優(yōu)點(diǎn)。同時，該試驗(yàn)結(jié)果顯示，白骨壤葉中生物堿對DPPH自由基和羥基自由基也都具有很好的清除作用。

因此，白骨壤葉中生物堿是一種很好的天然抗氧化活性物質(zhì)，進(jìn)一步完善了白骨壤作為一種中草藥的藥用價值，也為白骨

壤研發(fā)成為抗氧化和降血壓等功能性食品和藥品提供理論基礎(chǔ)。

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