三種染色方法在AFE死亡腐敗尸體肺組織中的應用研究

王尚文 李連鵬 戴偉 李楨 張桓

【摘要】目的：探討三種染色方法在AFE死亡腐敗尸體肺組織中的應用研究。方法：對2007年至2017年確診為AFE死亡孕產(chǎn)婦的腐敗尸體14例（腐敗組）和腐敗不明顯尸體15例（腐敗不明顯組）肺組織重新進行石蠟切片、應用三種方法染色，并對3名鑒定輔助人員進行考核和結(jié)果分析。結(jié)果：在被考核人員所采集的顯微診斷照片中，腐敗不明顯組全部檢出羊水成分，腐敗組存在漏診情況；APM染色法在羊水成分檢出方面較HE染色法和RK16染色法具有顯著優(yōu)勢。結(jié)論：（1）尸體解剖應盡早進行，尸體腐敗會對AFE診斷造成影響；（2）腐敗組中APM染色能提高羊水成分的檢出率；（3）腐敗對RK16染色法診斷AFE影響較為嚴重。

【關(guān)鍵詞】法醫(yī)病理學；羊水栓塞；抗角蛋白16染色；APM染色；病理診斷

羊水栓塞（amnioticfluidembolism，AFE）是指分娩過程中羊水進入母體血循環(huán)引起急性肺栓塞、過敏性休克、彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）、腎衰竭等一系列病理改變的嚴重分娩并發(fā)癥，死亡率可高達60%以上，是孕產(chǎn)婦死亡的主要原因之一。本文對本中心2007年至2017年鑒定為羊水栓塞死亡的29例孕產(chǎn)婦的檔案進行整理，對肺組織蠟塊重新進行石蠟切片、染色和組織學檢查，對其檢驗結(jié)果進行比較分析。

一、材料和方法

（一）材料

本文對本中心2007年至2017年鑒定為羊水栓塞死亡的29例孕產(chǎn)婦的檔案進行整理，并按照《醫(yī)療事故處理條例》和《醫(yī)療糾紛預防與處理條例（送審稿）》規(guī)定進行分組：腐敗不明顯組———死亡后常溫保存48小時內(nèi)進行尸檢的尸體和冰凍儲存7日內(nèi)進行尸檢的尸體，共15例；腐敗組———死亡后常溫保存48～60小時進行尸檢的尸體和冰凍儲存7～14日進行尸檢的尸體，共14例。

（二）方法

對上述29例AFE死亡孕產(chǎn)婦的162塊肺組織和10塊腐敗尸體肺組織（2例女性各5塊：1例為腦底動脈瘤破裂死亡，1例為鈍器打擊致重度顱腦損傷死亡）的蠟塊，共計172塊肺組織蠟塊進行重新編號，將腐敗組和腐敗不明顯組相互參雜，實現(xiàn)雙盲測試。對各肺組織蠟塊進行連續(xù)石蠟切片，取相連的三張切片，分別做常規(guī)組織HE染色、抗角蛋白16法（Resistkeratin-16，RK16）染色、阿爾辛藍-熒光桃紅-馬休黃雙重組織化學染色法（Alcianblue-phloxine-martius yellowhistochemicalstainingtechnique，APM染色）染色，進行法醫(yī)病理學考核檢查。

（三）查找羊水成分

被考核人為三名經(jīng)過兩年法醫(yī)病理學檢案實踐的法醫(yī)病理學方向研究生；被考核人將各切片中認為是羊水成分的部位，用leica顯微攝像系統(tǒng)拍400倍顯微診斷照片，將照片命名后由兩名從事十年以上法醫(yī)鑒定工作人員審核和判讀；后匯總被考核三人的觀察結(jié)果，被考核人檢出羊水成分的均值為最終實驗數(shù)據(jù)，得出三種方法對羊水成分檢出的有效性數(shù)據(jù)。

（四）統(tǒng)計方法

采用三人在相同時間檢出羊水成分次數(shù)的均數(shù)做為實驗數(shù)據(jù)，對檢測結(jié)果用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行方差分析和Post Hoc檢驗。

二、結(jié)果

（一）HE染色法

羊水成分非特異性著色：肺小血管內(nèi)檢見嗜酸性染色的角化上皮樣成分、胎糞呈黃褐色（圖1、2）；但腐敗存在影響，其中2張腐敗AFE肺組織切片經(jīng)高職人員審核后判定三名被考核人均存在漏診，1張其他死因的切片因血管內(nèi)膜腐敗自溶后脫落而導致1人誤診。

（二）APM染色法

角化上皮、粘液特異性著色：在APM染色中血管內(nèi)皮細胞核呈桃紅色，胞漿幾乎不著色，與角化上皮容易區(qū)分，肺小血管內(nèi)角化上皮呈桃紅色、粘液呈藍色、胎糞呈黃褐色（圖3、4）；但腐敗也存在影響，其中1張腐敗AFE肺組織切片經(jīng)高職人員審核后判定三名被考核人均存在漏診，無誤診切片。

（三）RK16免疫組化法

角化上皮特異性著色：肺小血管內(nèi)角化上皮呈黃褐色，但因腐敗導致其他部位非特異性著色明顯（圖5、6），在經(jīng)驗不豐富的鑒定人員中容易造成干擾和漏診；且腐敗亦存在明顯的影響，其中3張腐敗AFE肺組織切片經(jīng)高職人員審核后判定三名被考核人均存在漏診，1張其他死因的切片因血管內(nèi)膜腐敗自溶后脫落而導致2人誤診。

（四）檢出量的統(tǒng)計結(jié)果

1.死后經(jīng)歷時間（Thetimesincedeath，TSD）排外，三種方法檢出量的統(tǒng)計學分析（見表1）

對三種方法羊水分成分檢出量進行方差分析和PostHoc檢驗。APM雙重組化染色法與HE染色法相比，羊水成分檢出量具有顯著差異（P<0.05），APM雙重組化染色法與RK16免疫組化染色法相比，羊水成分檢出量具有顯著差異（P<0.05）。HE染色法與APM雙重組化法相比，羊水成分檢出量具有顯著差異（P<0.05），HE染色法與RK16免疫組化染色法相比，羊水成分檢出量無差異（P>0.05）。RK16免疫組化染色法與HE染色法相比，羊水成分檢出量無差異（P>0.05），RK16免疫組化染色法與APM雙重組化相比，羊水成分檢出量具有顯著差異（P<0.05）。

2.TSD為腐敗不明顯組，三種方法檢出量的統(tǒng)計學分析（見表2）

對三種方法羊水分成檢出量進行方差分析和PostHoc檢驗。APM雙重組化染色法與HE染色法相比，羊水成分檢出量具有顯著差異（P<0.05），APM雙重組化染色法與RK16免疫組化染色法相比，羊水成分檢出量具有顯著差異（P<0.05）。HE染色法與APM雙重組化法相比，羊水成分檢出量具有顯著差異（P<0.05），HE染色法與RK16免疫組化染色法相比，羊水成分檢出量無差異（P>0.05）。RK16免疫組化染色法與HE染色法相比，羊水成分檢出量無差異（P>0.05），RK16免疫組化染色法與APM雙重組化相比，羊水成分檢出量具有顯著差異（P<0.05）。

3.TSD為腐敗組，三種方法檢出量的統(tǒng)計學分析（見表3）

對三種方法羊水分成檢出量進行方差分析和PostHoc檢驗。APM雙重組化染色法與HE染色法相比，羊水成分檢出量具有顯著差異（P<0.05），APM雙重組化染色法與RK16免疫組化染色法相比，羊水成分檢出量具有顯著差異（P<0.05）。HE染色法與APM雙重組化法相比，羊水成分檢出量具有顯著差異（P<0.05），HE染色法與RK16免疫組化染色法相比，羊水成分檢出量無差異（P>0.05）。RK16免疫組化染色法與HE染色法相比，羊水成分檢出量無差異（P>0.05），RK16免疫組化染色法與APM雙重組化相比，羊水成分檢出量具有顯著差異（P<0.05）。

4.TSD為腐敗不明顯組與腐敗組，三種方法檢出量的統(tǒng)計學分析（見表4）

腐敗對RK16免疫組化影響較為嚴重；腐敗、出血對APM影響較小；APM染色下大血管中局部和少數(shù)小血管中檢出羊水成分，檢出率較HE染色和RK16免疫組化略高，且結(jié)果受組織腐敗的影響較HE和RK16免疫組化法小。

三、討論

羊水栓塞的法醫(yī)病理學診斷，傳統(tǒng)上是依據(jù)HE染色在肺小血管或其它臟器血管中（如子宮壁、心、腦）找到羊水成分，同時結(jié)合臨床經(jīng)過及全身其他臟器改變進行診斷。但是當栓塞于臟器小血管內(nèi)的羊水成分數(shù)量較少或形態(tài)不典型，或者由于選材部位不當或敏感性差時，易出現(xiàn)漏診和誤診，給羊水栓塞的法醫(yī)學鑒定帶來一定困難。且實踐工作中，由于各種原因?qū)е路ㄡt(yī)病理尸體解剖不能及時進行，導致組織腐敗，對于初從業(yè)的鑒定人員的干擾尤為明顯，極易形成漏診和誤診。

本實驗采用HE、APM、RK16三種染色法進行肺組織羊水成分的檢查性考核，從而得出檢出量的差異性結(jié)果，該差異性結(jié)果反映出AFE成分檢出率和檢出有效性的差異。研究結(jié)果顯示，在HE染色下羊水成分的檢出率不高；APM染色法可充分顯色羊水成分，并具有色彩鮮艷、對比清晰的特點，可有效提高檢測率，避免誤檢和漏檢。粘液作為一種羊水成分，在HE染色中沒有特異顯色，而在APM染色中，粘液呈鮮艷的藍色，與周圍組織色彩對比強烈。APM染色對自溶組織內(nèi)的角化上皮充分顯色，具有良好的穩(wěn)定性，不易受外界因素的影響。但是APM染色法不能特異性地使胎糞顯色，難以與肺組織中的炭末沉著相鑒別。

HE染色法是法醫(yī)病理石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一，染色方法成熟且性價比高。羊水成分中的角化上皮、粘液、毳毛在HE染色中均呈現(xiàn)深淺不同的紅色，胎糞呈黃褐色。但其著色中均為非特異性著色。在HE染色下進行AFE組織病理學診斷需要有長期的病理學實踐經(jīng)驗，否則極易造成漏診和誤診。

APM染色法是1994年報道的一種雙重組化染色法。羊水中的角化鱗狀上皮屬于角蛋白成分，含有豐富二硫鍵結(jié)構(gòu)的酸性粘多糖屬于強硫酸成分的陰離子異烯酸糖，易與Phloxine結(jié)合并染成桃紅色；Alcianblue是顯示酸性粘液物質(zhì)最特異的染料，其分子中帶正電荷的鹽鍵，與酸性粘液物質(zhì)中帶正電荷的酸性基團結(jié)合，對非（弱）硫酸酸性粘多糖進行著色（藍色）；Martiusyellow作為分色和增色劑，可以起到分色作用并保留角化上皮，增色粘液物質(zhì)。由于Martius yellow的分色作用十分明顯，應根據(jù)鏡下的分色情況適當調(diào)整，以控制纖維蛋白、血管內(nèi)皮細胞胞漿幾乎完全脫去桃紅色呈現(xiàn)無色而粘液的藍色又不被退去為準。產(chǎn)婦肺組織中檢出合體細胞也是診斷AFE的指標之一，但APM染色不能特異區(qū)分來自絨毛膜和蛻膜的合體細胞和大失血時骨髓產(chǎn)生的巨核細胞，故在產(chǎn)婦肺組織中單獨發(fā)現(xiàn)合體樣細胞還不能進行AFE的診斷，必需進行進一步的組織學檢查并結(jié)合臨床綜合考慮。本實驗（昆明地區(qū)室溫為20～25℃）Marius液中的最佳時間為15s，熒光桃紅液中的染色時間為5min，延長Alcianblue液中的染色時間至20min，以確保粘液成分顯色。本實驗中，腐敗、出血對APM影響較小；APM染色下大血管中局部和少數(shù)小血管中檢出羊水成分，檢出率較HE染色和RK16免疫組化略高，且結(jié)果受組織腐敗的影響較HE和RK16免疫組化法小。

角蛋白16主要表達于角化和增生的鱗狀細胞內(nèi)，胎兒角化上皮細胞內(nèi)含有豐富的角蛋白16，在AFE病例各臟器（主要是肺動脈分支和肺泡壁毛細血管）血管內(nèi)可出現(xiàn)角蛋白16陽性物質(zhì)，RK16免疫組化染色法對胎兒角化鱗狀上皮特異性強，檢出率高。但此類案例在醫(yī)療糾紛處理過程中常常由于各種原因，病理尸體解剖不能及時進行，組織自溶，血管內(nèi)皮脫落等，致使其形態(tài)學特征不典型，給診斷帶來困難。本實驗中，腐敗對RK16免疫組化影響較為嚴重。

綜上所述，尸體解剖應盡早進行，尸體腐敗會對AFE診斷造成影響；腐敗組中APM染色能提高羊水成分的檢出率；腐敗對RK16染色法診斷AFE影響較為嚴重。盡早進行尸體解剖，對死亡孕產(chǎn)婦的肺組織多部位、多次取材，選用靈敏性較高、對羊水成分顯色充分、與肺組織對比強烈的APM染色檢驗方法，可有效避免漏診誤診。

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作者簡介：王尚文（1982.06—），男，山西忻州人，實驗員，研究方向：法醫(yī)病理學教學、科研、鑒定；李連鵬（1976.01—），男，云南昆明人，主檢法醫(yī)師，研究方向：法醫(yī)學鑒定及研究；戴偉（1986.08—），男，漢族，云南曲靖人，學士，研究方向：法醫(yī)現(xiàn)場勘查、法醫(yī)學鑒定；李楨（1959.07—），女，昆明醫(yī)科大學法醫(yī)學院，教授，研究方向：法醫(yī)學教學、科研、鑒定研究；通訊作者：張桓，男，講師，研究方向：法醫(yī)病理學教學、科研、鑒定。