正清風痛寧對大鼠骨質(zhì)疏松性椎體骨折的影響＊

羅 霞，陳德森，李 莉，胡熙耀，萬 超，吳勝英＊＊

（1.十堰市太和醫(yī)院針灸科（湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學院基礎醫(yī)學院機能實驗室 十堰 442000）

正清風痛寧注射液的主要成分是鹽酸青藤堿，是從中草藥青風藤中提取的一種單體生物堿，具有消腫、抗炎、止痛等功效[1,2]。前列腺素E2（PGE2）是重要的致痛物質(zhì)，可引起的痛覺過敏，6-酮-前列腺素E1α（6-keto-PGE1α）是PGE2的前體，動物實驗發(fā)現(xiàn)青藤堿可抑制6-keto-PGE1α合成，且N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑可抑制這種痛覺過敏現(xiàn)象，而N-甲基-D-天冬氨酸受體興奮與一氧化氮（NO）的活化密切相關[3]。NO由神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）催化L-精氨酸后生成，是一種重要的炎癥介質(zhì)和擴血管物質(zhì)，可介導感覺信號的傳遞，增加對致痛物質(zhì)的PGE2敏感性，其合成增多會提高神經(jīng)突觸的興奮性，增強對機體對痛覺反應的敏感性[4]。八肽膽囊收縮素（CCK-8）具有拮抗阿片肽的鎮(zhèn)痛作用，為目前已知的抗阿片肽作用最強的物質(zhì)，腦脊液中CCK-8含量與痛覺相關[5,6]。青藤堿及其制劑正清風痛寧注射液的鎮(zhèn)痛作用研究較多，但其對骨質(zhì)疏松性椎體骨折引起的疼痛和骨量降低影響骨折愈合的研究卻鮮有報導。本研究試圖從大鼠骨質(zhì)疏松性椎體骨折模型中致痛相關因子及青藤堿制劑正清風痛寧注射液對其影響來研究其作用機制。

1 實驗材料

1.1 藥物與試劑

正清風痛寧注射液（湖南正清制藥集團股份有限公司，國藥準字：02372409Z）；CCK-8、6-keto-PGE1α、NO及nNOS檢測ELISA試劑盒均購自上海藍基生物科技有限公司。

1.2 實驗動物

SPF級健康雌性SD大鼠40只，鼠齡3個月，體質(zhì)量（180-190）g，由湖北省實驗動物研究中心提供。動物生產(chǎn)合格證號：SCX K（鄂）2017-0005。

2 實驗方法

2.1 大鼠骨質(zhì)疏松性椎體骨折模型

取SD大鼠30只，參考文獻[7]大鼠麻醉前均禁水禁食6 h，用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，麻醉成功后將其腹部朝上固定在手術臺上。下腹部正中備皮，碘伏消毒，用手術刀切開下腹部正中皮膚、分離淺筋膜、深筋膜直達肌層，分離輸卵管并沿輸卵管尋找卵巢，然后用絲線結扎輸卵管峽部，剪去雙側(cè)卵巢。然后分層縫合，最后再次碘伏消毒縫合皮膚。參考文獻[8]，標準飼料飼養(yǎng)2個月后再同次方法麻醉大鼠，腹部向下固定，相當于椎體L3水平備皮，皮膚消毒?？v行切開大鼠L3椎體皮膚、暴露腹膜后間隙、分離背闊肌、背最長肌、棘間肌和韌帶，暴露L3椎間盤，從椎體側(cè)前方剪斷L3椎體前緣，然后分層縫合。術后不做內(nèi)固定，剪斷的椎體斷端骨小梁會因相互擠壓、嵌插、扭曲而導致L3椎體變短，在內(nèi)就會因為自身重力和運動等因素的作用下壓縮變短成模[9]。

2.2 實驗動物分組與處理

將上述手術造模的30只SD大鼠，采用隨機數(shù)字表編號隨機分隨機分模型組、正清風痛寧0.5 mg組和2 mg組，每組10只。剩下的10只未手術的正常鼠設為假手術組，本組僅做皮膚消毒和備皮處理，不手術，作為對照。在建模術后4周起，在L3脊柱兩側(cè)夾脊穴注射正清風痛寧，0.5 mg組（0.5 mg）和2 mg組（2 mg）分別于L3夾脊穴注射正清風痛寧注射液進行治療，假手術組和模型組給予等體積生理鹽。以上各組每天注射治療1次，共4周。實驗動物12 h交替光照并分籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水及活動，動物房溫度為25±2℃，濕度75%。

2.3 主要檢測指標

于成模后及治療2周時分別取腦脊液，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測八肽膽囊收縮素（CCK-8）、6-酮-前列腺素E1α（6-keto-PGE1α）、一氧化氮（NO）及神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）含量，采用骨定量超聲診斷技術檢測骨折腰椎骨定量振幅衰減（BUA）及骨密度（BMD）。

表1 兩組BUA及BMD比較（n=10，）

注：BUA：骨定量振幅衰減；BMD：骨密度；與假手術組比較，△P＜0.05；與同組比較，▲P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

2.4 疼痛行為學觀察

采用機械觸誘發(fā)痛和自發(fā)痛測定l、2、3、4周機械縮足閾值（MWT）和自發(fā)痛抬腿次數(shù)及抬腿持續(xù)時間。MWT測定[10]：將大鼠置于機械觸誘發(fā)痛網(wǎng)格上，適應30 min后用不同折力的von Frey纖毛依次刺激左后足底（6-8秒），以大鼠產(chǎn)生明顯的縮爪或舔足為陽性標準，每根針絲測量5次，每只大鼠均從0.4 g的針絲開始刺激，以出現(xiàn)縮足反射3次以上的最小von Frey纖維強度為機械刺激縮足閾值（MWT）。大鼠自發(fā)痛測定：將大鼠置于特制的有機玻璃觀測室，動物適應30 min后開始實驗，觀察30 min內(nèi)大鼠后肢自發(fā)抬腿次數(shù)及抬腿持續(xù)時間，并計算治療4周后足縮足閾值均值。

2.5 統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1 正清風痛寧對大鼠BUA及BMD的影響

假手術組成模后和治療后BUA及BMD無明顯變化（P＞0.05）。模型組、正清風痛寧0.5 mg組和2 mg組成模后與假手術組比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組治療后BUA及BMD均明顯降低，與假手術組比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；2 mg組治療后BUA及BMD均明顯升高，與同組成模后和模型組比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），（表1）。

3.2 正清風痛寧對大鼠NO、nNOS、CCK-8和6-keto-PGE1α的影響

假手術組成模后和治療后NO、nNOS、CCK-8和6-keto-PGE1α含量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。模型組、正清風痛寧0.5 mg組和2 mg組成模后與假手術組比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；2 mg組治療后與同組成模后和模型組比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（見表2）。

表2 兩組NO、nNOS、CCK-8和6-keto-PGE1α比較（n=10，）

表2 兩組NO、nNOS、CCK-8和6-keto-PGE1α比較（n=10，）

注：八肽膽囊收縮素（CCK-8）、6-酮-前列腺素E1α（6-keto-PGE1α）、一氧化氮（NO）及神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）；與假手術組比較，△P＜0.05；與同組比較，▲P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

3.3 正清風痛寧對大鼠自發(fā)痛的影響

假手術組成模后和治療后抬腿次數(shù)、抬腿持續(xù)時間及治療4周后足縮足閾值均值比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。模型組治療后抬腿次數(shù)和抬腿持續(xù)時間均增多和延長，治療4周后足縮足閾值均值降低，與假手術組比，差異有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。正清風痛寧0.5 mg組和2 mg組成模后與假手術組比，差異有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；2 mg組治療后與同組成模后和模型組比，差異有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表3）。

表3 大鼠自發(fā)痛行為及4周后足縮足閾值均值比較（n=10，）

表3 大鼠自發(fā)痛行為及4周后足縮足閾值均值比較（n=10，）

注：與假手術組比較，△P＜0.05；與同組比較，▲P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

3.4 正清風痛寧對大鼠MWT的影響

假手術組MWT在治療期間無明顯變化，前后比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。模型組和正清風痛寧0.5 mg組MWT隨治療時間延長逐步降低，與假手術組比，差異有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；2 mg組MWT隨治療時間延長逐步提高，治療后與同組成模后和模型組比，差異有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表4）。

表4 大鼠MWT在治療期間變化情況比較（n=10，）

表4 大鼠MWT在治療期間變化情況比較（n=10，）

注：與假手術組比較，△P＜0.05；與同組比較，▲P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

4 討論

骨質(zhì)疏發(fā)病率逐年攀升，屬骨科類常見代謝性骨病變，中老年人器官處于衰退期，在骨代謝過程當中，骨的形成和骨吸收之間的偶聯(lián)發(fā)生缺陷，鈣磷等物質(zhì)代謝失衡，骨組織質(zhì)量降低，骨密度減小，骨質(zhì)脆性增加而形成老年性骨質(zhì)疏癥[11]。同時，由于患者骨質(zhì)不斷吸收骨組織，因此骨強度降低，在外力的作用下極容易發(fā)生骨折，臨床出現(xiàn)駝背、身長縮短、疼痛等臨床癥狀，嚴重影響老年人的正常生活[12,13]。骨質(zhì)疏松性椎體骨折者一般經(jīng)中醫(yī)中藥保守治療可達到滿意臨床療效，但嚴重者可能造成消化及呼吸等多系統(tǒng)功能障礙，甚至導致死亡。因此，骨質(zhì)疏松性椎體骨折應及時治療以改善臨床癥狀，提高患者生存質(zhì)量[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿及其制劑正清風痛寧具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗風濕等藥理作用，在治療骨質(zhì)疏松、骨性關節(jié)炎、等引起的疼痛性疾病有肯定療效[17,18]。

有研究表明，骨折后受壓組織因血液循環(huán)不足，PGE2、CCK-8等會大量集聚加重骨折部位周圍肌肉發(fā)生炎癥反應，而6-keto-PGE1α為PGE2的終代謝產(chǎn)物，具有強烈的血管收縮作用及致痛作用，可直接刺激神經(jīng)根引起疼痛，或增加神經(jīng)根對緩激肽等致痛物質(zhì)的敏感性，使神經(jīng)根痛閾下降引起疼痛加劇[19]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，由PGE2誘導的痛覺過敏可被N-甲基-D-天冬氨酸受體的拮抗劑所抑制，N-甲基-D-天冬氨酸受體興奮與NO的活化密切相關，NO的活化抑制后，PGE2所致傷害反應也會隨之劑量依賴性降低，由此提示PGE2誘導的痛覺過敏是由NO介導的感覺信號傳遞的相互作用介導的，而青藤堿能顯著降低內(nèi)皮細胞分泌NO的作用[20,21]。

在本實驗中，選用中藥制劑正清風痛寧夾脊穴注射，該治療方法遵循中醫(yī)經(jīng)穴治療體系這一理論依據(jù)，以經(jīng)絡為載體，使“針、藥、穴”綜合作用于骨折部位及神經(jīng)，可明顯提高藥物吸收和藥物治療作用[22]。觀察發(fā)現(xiàn)，骨定量超聲顯示BUA及BMD均明顯高于模型組。在本研究中所用中醫(yī)制劑正清風痛寧注射液是從中藥青風藤中提取青藤堿，青風藤藥性溫、味苦、辛，祛風濕，通經(jīng)絡[23]。這種活經(jīng)通絡的作用可增加骨折部位的血流量，加速局部新陳代謝，可能在一定程度上增加了骨鈣沉積。正清風痛寧注射是否是通過調(diào)節(jié)鈣磷代謝、減少骨量丟失、增加骨鈣沉積而提高骨密度，進而促進大鼠骨質(zhì)疏松性椎體骨折愈合還有待進行鈣磷代謝等方面的研究。本研究還觀察到2 mg組nNOS、NO、CCK-8和6-keto-PGE1α明顯低于模型組。NO是一種重要的炎癥介質(zhì)，nNOS催化L-精氨酸后生成NO，可介導感覺信號的傳遞并增加對致痛物質(zhì)的敏感性。機體在傷害性刺激后，nNOS即出現(xiàn)升高，此時Ca2+進人背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角神纖維胞內(nèi)，Ca2+依賴性的nNOS被激活，nNOS催化L-精氨酸催化生成NO并彌散至突觸神經(jīng)元，進一步激活鳥苷酸環(huán)化酶，使神經(jīng)突觸興奮性增強，對刺激造成的痛覺反應敏感性增強[4]。2 mg組治療后nNOS明顯低于模型組，這可能是穴位注射正清風痛寧注射液，抑制nNOS催化L-精氨酸，降低NO內(nèi)皮細胞分泌而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用有關。另一方面，有動物實驗證實，CCK-8具有抗阿片肽作用，拮抗阿片肽的鎮(zhèn)痛作用[24]。2 mg組治療后CCK-8均明顯低于模型組，提示正清風痛寧注射液可能通過抑制CCK-8分泌來降低其拮抗阿片肽，從而產(chǎn)生中樞鎮(zhèn)痛效應。實驗觀察到2 mg組抬腿次數(shù)和抬腿持續(xù)時間降低，大鼠4周后足縮足閾值均值明顯提高，1、2、3、4周MWT逐步提高，這也直接證實上述理論。

綜上所述，骨質(zhì)疏松性椎體骨折會造成嚴重的疼痛，正清風痛寧注射中的青藤堿在穴位注射吸收后，對骨質(zhì)疏松性椎體骨折疼痛產(chǎn)生肯定的治療作用。正清風痛寧穴位注射可能是通過增加大鼠下丘腦nNOS分泌、抑制NO和6-keto-PGE1α合成、降低CCK-8而產(chǎn)生中樞鎮(zhèn)痛作用，這一作用可能成為治療老年骨質(zhì)疏松性椎體骨折疼痛及促進骨折愈合的新靶點。

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