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    保元排毒丸對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟Wnt/β-catenin信號通路的影響*

    2018-05-10 03:18:15王身菊朱美鳳鄭宏香
    關(guān)鍵詞:貝沙坦腎小管膠原

    王身菊,朱美鳳,鄭宏香,張 玲,陳 岱

    (南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬常州市中醫(yī)醫(yī)院 常州 213000)

    據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果[1]顯示,我國年齡18歲以上的成人慢性腎臟?。–KD)的患病率為10.8%,據(jù)此估算中國現(xiàn)有CKD患者達(dá)到1.2億。CKD的發(fā)病率和病死率逐年升高,目前CKD已成為全球急待解決的健康問題[2]。腎間質(zhì)纖維化(Renal interstitial fibrosis RIF)的嚴(yán)重程度能判斷腎功能受損害程度,對CKD的預(yù)后有決定性作用。延緩和防治腎纖維化是防治慢性腎臟病進(jìn)展的關(guān)鍵。本課題組在以往的臨床實(shí)踐中,采用純中藥制劑保元排毒丸(保元排毒丸由生黃芪、黃精、生曬參、冬蟲夏草、生大黃、六月雪、接骨木、丹參、陳皮、六神曲、木靈芝)治療CKD患者,取得了較滿意的臨床療效[3-5]。本實(shí)驗(yàn)通過制作UUO大鼠腎臟纖維化模型,觀察保元排毒丸對UUO模型大鼠腎臟病理的影響及對Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控,以探討保元排毒丸延緩腎纖維化的機(jī)理。

    1 材料

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    清潔級健康雄性SD大鼠48只,7-8周,體質(zhì)量190±8 g,購自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號碼SCXK(蘇):2016-0002。進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)普通飼料,自由飲水,日常光照。適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

    保元排毒丸(藥物批號160902)來源于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬常州市中醫(yī)醫(yī)院制劑室。制作工藝:取生黃芪、黃精、生曬參、冬蟲夏草、陳皮、黃精、六神曲、半量的生大黃共7味中藥混合研成細(xì)粉過80-100目篩備用;另取丹參、六月雪、木靈芝、接骨木及半量生大黃及上述各藥的粗粉共加水煎煮二次,第一次1.5 h,第二次1 h,合并濾液,靜置,取上清液濃縮至相對密度為1.01以上備用。取上述粉末用濃縮液泛丸,丸粒制成梧桐子大小,整粒,60-80℃熱風(fēng)循環(huán)干燥即得。每丸重0.14 g,相當(dāng)于生藥含量0.38 g。厄貝沙坦(商品名:安博維),由賽諾菲杭州制藥有限公司生產(chǎn),規(guī)格150 mg/片。

    1.3 主要試劑

    蘇木素-伊紅染液(武漢谷歌生物科技有限公司貨號G1005)、Masson染色試劑盒(武漢谷歌生物科技有限公司 貨號G1006),DAB顯色試劑盒(DAKO);TRIS(Solarbio T8060),Trizol Reagent、BCA蛋白定量檢測試劑盒及SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(武漢塞維爾生物科技有限公司),兔源性E-cadherin抗體(三鷹公司,貨號20874-1-AP),兔源性Ⅰ型膠原抗體(三鷹公司,貨號14695-1-AP),兔源性β-catenin抗體(servicebio,GB11015);兔源性β-actin(servicebio GB13001-1)。引物設(shè)計(jì)合成(武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司),Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo K1622)、Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)(Roche 04 913 914 001)、HyPure TMMolecular Biology Grade Water(HyClone SH30538.02)。

    1.4 主要儀器

    JJ-12J型脫水機(jī)、JB-P5包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)、烤箱、RM2016病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)、Nikon Eclipse CI正置光學(xué)顯微鏡。752-P紫外分光光度計(jì)(上?,F(xiàn)科儀器有限公司)、neofuge 15R冷凍離心機(jī)(heal force)、DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)、alphaEaseFC灰度分析軟件(Alpha Innotech)、Stepone plus熒光定量PCR儀(ABI)、多樣品研磨珠均質(zhì)儀(Omni)。

    2 方法

    2.1 分組及UUO大鼠模型建立

    48只清潔級健康雄性SD大鼠,按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分六組:假手術(shù)組、UUO組、厄貝沙坦組和保元排毒丸低、中、高劑量組,每組8只。除假手術(shù)組外,其余各組均按文獻(xiàn)[6]方法造模。以3%戊巴比妥鈉,按照0.2mL/100g腹腔注射麻醉,麻醉成功后,固定大鼠,剃去右背部毛發(fā),暴露皮膚,聚維酮碘消毒皮膚3遍,鋪無菌手術(shù)巾。在距脊柱約1-1.5 cm,肋緣下做長約1-1.5 cm縱行切口,逐層剝離皮下筋膜,切開肌肉,暴露出腎盂及輸尿管,玻璃分針分離出右輸尿管,近腎盂處結(jié)扎輸尿管兩次,從兩結(jié)扎中間剪斷輸尿管,后逐層縫合,關(guān)閉腹腔,以聚維酮碘消毒皮膚切口,用無菌敷料覆蓋包扎。假手術(shù)組只分離右輸尿管,不結(jié)扎,然后逐層縫合。

    2.2 給藥

    將保元排毒丸溶于蒸餾水中,分別配成濃度為25%、12.5%、6.25%的溶液,放置冰箱冷藏以備用。造模第2天開始給藥,共灌胃14天。保元排毒丸低、中、高劑量組分別給予保元排毒丸1.25g·kg-1/天、2.5g·kg-1/天、5.0g·kg-1/天;厄貝沙坦組:給予厄貝沙坦12.5g·kg-1/天;假手術(shù)組和UUO組給予自由進(jìn)食及等容積生理鹽水灌胃。大鼠給藥劑量參照文獻(xiàn)[7],低劑量設(shè)為平均臨床等效劑量,中、高劑量分別相當(dāng)于平均臨床等效劑量的2倍和4倍。

    2.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

    2.3.1 腎組織病理

    于末次灌胃禁食不禁水24 h后按前法麻醉取右腎,剔除包膜,用無菌紗布吸干水份,電子天平稱取右側(cè)腎臟濕重后,縱切一半右腎置于4%多聚甲醛中固定;右腎另一半分裝于EPP管中于-80℃保存,待進(jìn)一步檢測。固定24 h后,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋,切4.0 μm薄片。按試劑盒方法進(jìn)行HE、Masson染色,顯微鏡下觀察腎臟病理學(xué)改變。HE染色腎小管間質(zhì)損傷按Banff分級進(jìn)行0-3級半定量計(jì)分。記錄連續(xù)不重疊的10個(gè)200倍視野的數(shù)值,取其平均值比較每例切片的腎小管間質(zhì)區(qū)域病變的程度。Masson染色半定量統(tǒng)計(jì)腎間質(zhì)纖維化情況。在光學(xué)顯微鏡200倍高倍鏡下連續(xù)觀察每張切片不重疊的10個(gè)視野,計(jì)算出每個(gè)視野下腎間質(zhì)苯胺藍(lán)染色面積占整個(gè)視野的比例,記錄每張切片的數(shù)值后取其平均值來比較各組腎間質(zhì)纖維化情況。

    2.3.2 Western Blot法測腎組織E-cadherin、Collagen I、β-Catenin表達(dá)水平

    取保存于-80℃的腎組織,用冷PBS洗滌2-3次,去除血污,剪成小塊置于勻漿器,加入適量裂解液后冰上徹底勻漿。1 500 g離心10 min,收集上清,即為總蛋白溶液,BCA法測蛋白濃度。每上樣孔加4 μg總蛋白行10%SDS-PAGE膠電泳。濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用封閉液封閉1-2 h后,各組分別加入適當(dāng)稀釋后的 E-cadherin(1∶2000)、Collagen I(1∶1 000)、β-Catenin(1∶1 000)抗體4℃過夜。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗用TBST稀釋3 000倍,室溫孵育30 min后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次,每次5 min,化學(xué)發(fā)光劑ECL反應(yīng)5 min,曝光,掃描蛋白條帶,將膠片進(jìn)行掃描存檔,PhotoShop整理去色,Alpha軟件處理系統(tǒng)分析以所測得的各指標(biāo)吸光度與內(nèi)參照β-actin吸光度的比值代表定量值。

    圖1 各組大鼠腎組織HE染色(×200)

    2.3.3 Real-time PCR檢測Wnt4、β-catenin mRNA表達(dá)

    Wnt4、β-catenin的引物設(shè)計(jì)合成由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司完成。引物序列:WNT4:正義鏈5′-GGA AGG TGG TGA CAC AAG GGA-3′,反義鏈5′-CAT AGG CGA TGT TGT CCG AGC-3′,片段長度189 bp。β-catenin:正義鏈 5′-TGG TGA AAA TGC TTG GGT CG-3′,反義鏈5′-TCT GAA GGC AGT CTG TCG TAA TAG-3′片段長度189 bp。內(nèi)參GAPDH:正義鏈5′-TTC CTA CCC CCA ATG TAT CCG-3′,反義鏈5′-CATGAGGTCCACCACCCTGTT-3′,片段長度281bp。

    提取大鼠腎組織總RNA、應(yīng)用微量核酸分光光度計(jì)檢測總RNA的濃度和純度;以20 μL為體系進(jìn)行cDNA第一鏈的合成,采用熒光定量PCR儀,以25 μL為反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增,取0.2 mL PCR管,配制如下反應(yīng)體系(每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管):2×qPCR Mix12.5 μL、7.5 μM基因引物2.0 μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5 μL、dH2O8.0μL。PCR擴(kuò)增:預(yù)變性95℃,10min;循環(huán)(40次)95℃,15 s→60℃,60 s;溶解曲線75℃→95℃,每20 s升溫1℃。反應(yīng)完成后,采用2-△△CT計(jì)算法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

    表1 各組對腎臟病理的影響(HE和Masson評分)

    2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(sd),組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,P值小于或等于0.05將被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    保元排毒丸高劑量組在造模過程中因麻醉而死亡一只。

    3.1 腎組織HE染色和Masson染色

    HE染色:UUO組見大部分腎小管管腔擴(kuò)張明顯,部分可見有蛋白或細(xì)胞管型,腎間質(zhì)彌漫性炎性細(xì)胞浸潤,部分腎小管萎縮或塌陷,部分腎小管上皮細(xì)胞脫落、溶解。保元排毒丸低、中、高劑量組和厄貝沙坦組腎小管輕度擴(kuò)張,腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整,間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤比UUO組減少(P<0.01)。厄貝沙坦組與保元排毒丸各劑量組的病理變化大致相當(dāng)(見圖1、表1)。

    Masson染色見假手術(shù)組腎小管間質(zhì)、腎小球基底膜、系膜區(qū)無明顯膠原沉積,UUO組見增寬的間質(zhì)有較多藍(lán)紫色條索狀膠原,保元排毒丸各劑量組和厄貝沙坦組藍(lán)紫色膠原沉積明顯少于UUO組(P<0.01)(計(jì)結(jié)果見圖2、表1)。

    圖2 各組大鼠腎組織Msson染色(×200)

    3.2 腎組織E-cadherin、Collagen I、β-Catenin表達(dá)水平

    如圖3、表2所示,與假手術(shù)組比較,UUO組E-cadherin表達(dá)均明顯減少(P<0.01),與UUO組比較,保元排毒丸低、中、高劑量組和厄貝沙坦組E-cadherin的表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01);與假手術(shù)組比較,UUO組Collagen I、β-Catenin表達(dá)顯著升高(P<0.01);保元排毒丸低、中、高劑量組和厄貝沙坦組Collagen I、β-Catenin表達(dá)明顯少于UUO組(P<0.01)。

    圖3 各組腎組織E-cadherin、Collagen I、β-Catenin蛋白的表達(dá)

    表2 各組E-cadherin、Collagen I、β-Catenin蛋白結(jié)果比較

    3.3 Real-time PCR檢測Wnt4、β-catenin mRNA表達(dá)

    如表3所示,與假手術(shù)組比較,UUO組和各給藥組Wnt4、β-catenin表達(dá)均明顯升高(P<0.01);與UUO組比較,各給藥組Wnt4、β-catenin mRNA表達(dá)明顯低于UUO 組(P<0.05,P<0.01),保元排毒丸低劑量組Wnt4的表達(dá)低于厄貝沙坦(P<0.05)。

    表3 各組對大鼠Wnt4、β-catenin mRNA的表達(dá)

    4 討論

    腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF)主要表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞的增多及膠原、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[8]。RIF的發(fā)生發(fā)展受轉(zhuǎn)化生長因子、結(jié)締組織生長因子等細(xì)胞因子和TGF-β/smad、Wnt/β-catenin等信號通路的調(diào)控,其中,Wnt/βcatenin信號通路在促進(jìn)RIF的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。

    正常情況機(jī)體腎臟Wnt信號是沉默的[9]。當(dāng)βcatenin在細(xì)胞核內(nèi)蓄積時(shí),能激活Wnt信號通路,啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致細(xì)胞增生、侵襲和轉(zhuǎn)移。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,是該信號通路激活的標(biāo)志[10]。Surendran等[11]發(fā)現(xiàn)UUO模型中Wnt4在集合管中有表達(dá),腎小管上皮細(xì)胞胞漿中βcatenin表達(dá)增高。He等[12]證實(shí)UUO模型小鼠腎臟Wnt/β-catenin信號活性明顯增強(qiáng),Wnt/β-catenin信號通路的激活可促進(jìn)腎纖維化。Villa等[13]表示,在UUO模型中,抑制β-catenin信號通路可減少腎臟纖維化。He等[14]發(fā)現(xiàn)抑制Wnt/β-catenin信號通路可以減少阿霉素腎病小鼠蛋白尿,抑制腎損傷和腎纖維化,均證實(shí)了Wnt信號通路在腎間質(zhì)纖維化中發(fā)揮了重要作用。故本實(shí)驗(yàn)通過UUO模型大鼠觀察保元排毒丸對Wnt4、β-catenin表達(dá)的影響。腎間質(zhì)纖維化的主要成分是Ⅰ型膠原(collagensⅠ,ColⅠ)和Ⅲ型膠原(collagensⅢ,ColⅢ),其mRNA能合理地評估膠原的合成[15],本實(shí)驗(yàn)選用Ⅰ型膠原的蛋白表達(dá)反映腎間質(zhì)纖維化的程度。

    保元排毒丸是全國名老中醫(yī)張志堅(jiān)教授治療CKD及腎纖維化的經(jīng)驗(yàn)方。張老將腎纖維化的病機(jī)歸納為“虛”、“濕”、“瘀”三個(gè)方面,腎元虧虛是腎纖維化始動(dòng)原因,濕熱、濕濁貫穿整過病程中、久病致瘀,濁聚成毒,病機(jī)關(guān)鍵是“腎元虧虛、濕濁毒瘀”,故治療以補(bǔ)益腎元、祛濕化瘀、泄?jié)崤哦緸榉?。保元排毒丸?jù)此病機(jī)治法研制而成,由生黃芪、黃精、生曬參、冬蟲夏草、接骨木、生大黃、六月雪、丹參、陳皮、六神曲、木靈芝組成,為常州市中醫(yī)醫(yī)院使用了三十余年的治療CKD的??浦苿R床療效可靠[3-5]。方中生黃芪甘溫益氣健脾、補(bǔ)肺固表、利水消腫;黃精甘平,歸肺、脾、腎三經(jīng),補(bǔ)腎潤肺健脾;生曬參,大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)脾生津;冬蟲夏草甘溫益氣,益腎補(bǔ)肺,金水同補(bǔ);四藥共奏補(bǔ)益腎元之功,治病之本。接骨木甘苦平,祛風(fēng)利濕、活血化瘀;六月雪性平偏涼,活血化瘀、通經(jīng)利水、清熱解毒、利濕泄?jié)?;生大黃苦寒瀉下、蕩滌腸胃、解毒化瘀、降泄?jié)嵝埃坏?,苦寒活血祛瘀;四藥共奏祛濕化瘀、泄?jié)崤哦局?,治病之?biāo)。陳皮,補(bǔ)氣健脾、和胃止嘔;六神曲,消食和胃;木靈芝益氣養(yǎng)心安神。諸藥相伍,補(bǔ)益腎元、祛濕化瘀、泄?jié)崤哦?。縱觀全方補(bǔ)泄共施、升降相伍、清消并用,使清得以升,濁得以降,濕得以祛,毒得以解,從而氣機(jī)通順,三焦暢達(dá)。

    本實(shí)驗(yàn)HE染色UUO組見大部分腎小管管腔擴(kuò)張明顯、部分可見有蛋白或細(xì)胞管型、腎間質(zhì)彌漫性炎性細(xì)胞浸潤、腎小管萎縮或塌陷、部分腎小管上皮細(xì)胞脫落、溶解;Masson染色見UUO組見增寬的間質(zhì)有較多藍(lán)紫色條索狀膠原。UUO組E-cadherin表達(dá)明顯少于假手術(shù)組和保元排毒丸各劑量組(P<0.01),提示UUO組腎小管上皮的受損嚴(yán)重。UUO組ColⅠ的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組及保元排毒丸各劑量組,提示UUO組纖維化程度重,這說明造模成功。保元排毒丸各劑量組腎小管擴(kuò)張程度輕、腎間質(zhì)病變程度輕、腎間質(zhì)纖維化程度輕,保元排毒丸各劑量組ColⅠ的表達(dá)明顯低于UUO組(P<0.01),提示保元排毒丸有延緩腎纖維化的作用。

    本實(shí)驗(yàn)用Western Blot法和Real-time PCR法均證實(shí)UUO組β-catenin表達(dá)均明顯高于假手術(shù)組(P<0.01),UUO組Wnt4表達(dá)亦明顯高于假手術(shù)組(P<0.01);說明在UUO模型大鼠中,Wnt4和β-catenin的表達(dá)增強(qiáng),Wnt/β-catenin信號通路被激活,這與文獻(xiàn)報(bào)道符合[16];經(jīng)過保元排毒丸治療Wnt4和β-catenin表達(dá)均低于UUO組(P<0.01),提示保元排毒丸能夠下調(diào)Wnt4和β-catenin的表達(dá),保元排毒丸可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路起到延緩腎纖維化的作用。

    厄貝沙坦能減少腎小球細(xì)胞外基質(zhì)蓄積,延緩腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展[17],可部分通過下調(diào)β-catenin/Snail的表達(dá)抑制UUO大鼠RIF[18]。本實(shí)驗(yàn)保元排毒丸各劑量組抑制腎纖維化與厄貝沙坦效果相似。本實(shí)驗(yàn)將保元排毒丸設(shè)計(jì)了低、中、高三個(gè)劑量組,低劑量相當(dāng)于平均臨床等效劑量,低、中、高劑量組未見明顯劑量依賴性量效關(guān)系,有可能低劑量是最有效劑量。

    綜上所述,在UUO模型大鼠中Wnt4和β-catenin的表達(dá)增強(qiáng),Wnt/β-catenin信號通路被激活,保元排毒丸可下調(diào)Wnt4和β-catenin的表達(dá);保元排毒丸有延緩腎纖維化的作用,其機(jī)理可能是通過抑制Wnt/βcatenin信號通路起到延緩腎纖維化的作用。

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