心脈通復(fù)方提取工藝優(yōu)化及顆粒成型性考察＊

朱榮榮，李 玲，王 靖，張莉莉，王 琪，王 冰，張偉榮

（上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 上海 201203）

冠心?。–oronary heart disease,CHD）是造成世界死亡的主要原因之一[1]。根據(jù)WHO，截至2008年，世界范圍內(nèi)7 254 000例死亡由冠心病造成[2]。冠心病是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化或（和）功能性改變致使血管腔狹窄或阻塞，導(dǎo)致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病。缺血再灌注造成的心肌損傷是冠狀動(dòng)脈疾病原發(fā)性病理表現(xiàn)的原因[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療的不良反應(yīng)、復(fù)發(fā)率及致死率居高不下；而中醫(yī)藥從整體的觀點(diǎn)出發(fā)，辨證施治，通過補(bǔ)氣活血[4]等方法，可克服現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療的不足。

中藥復(fù)方心脈通為臨床多年應(yīng)用的有效驗(yàn)方，全方由君藥茶樹根，臣藥益母草，以及三七、川芎、瓜蔞五味藥材組成，具有強(qiáng)心利尿，活血化瘀，開胸散結(jié)之功效，臨床上用于治療冠心病心肌缺血，效果明確。為了克服傳統(tǒng)湯劑單次口服劑量大、服用與攜帶不便的缺點(diǎn)，擬將本處方制備成便于攜帶、保存與服用的顆粒劑。本文采用正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)方水提工藝，以單因素實(shí)驗(yàn)初步考察顆粒劑成型工藝，并測(cè)定顆粒劑中主要有效成分的含量，對(duì)顆粒劑中有關(guān)藥材進(jìn)行薄層鑒別并檢查顆粒劑的粒度、水分、溶化性。通過復(fù)方提取優(yōu)化及顆粒劑主要輔料篩選實(shí)驗(yàn)，本文將為后續(xù)心脈通復(fù)方藥效研究提供提取物制備工藝，為制劑工藝優(yōu)選實(shí)驗(yàn)提供輔料選擇的前期數(shù)據(jù)，并為該復(fù)方新藥的開發(fā)及應(yīng)用提供一定依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent Cary 8454紫外-可見分光光度計(jì)（安捷倫科技有限公司）；JH202電子天平（上海精密儀器儀表有限公司）；X105BDU梅特勒-托利多電子精密天平（北京歐信勝科技有限公司）；ZNHW-II型2000毫升電熱套（鞏義市予華有限責(zé)任公司）；TDL-50B離心機(jī)（上海精密儀器儀表有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；IKA?Vortex 3型圓周振蕩器（上海萊貝科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥材

原花青素對(duì)照品（批號(hào)：wkq16051402，四川省維克奇生物科技有限公司）；鹽酸水蘇堿對(duì)照品（批號(hào)：16072510，北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司）；人參皂苷Rg1（批號(hào)：22427-39-0，上海詩丹德生物技術(shù)有限公司）；阿魏酸（批號(hào)：1135-24-6，上海詩丹德生物技術(shù)有限公司）；乳糖、可溶性淀粉、糊精（玉米）、聚乙烯吡咯烷酮K-30等輔料與甲醇、乙醚、硫酸、鹽酸、95%乙醇等試劑為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水為實(shí)驗(yàn)室自制。

茶樹根為山茶科山茶屬植物茶Camellia sinensis(L.)O.Kuntze的干燥根。益母草為唇形科植物益母草Leonurus Japonicus Houtt.的干燥地上全草。三七為五加科植物三七Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen的干燥根。川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort的根莖。瓜蔞為葫蘆科植物栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.的干燥成熟果實(shí)。藥材飲片均購自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)方水提工藝

2.1.1 吸水率測(cè)定

稱取茶樹根、益母草等1倍處方量的藥材，稱重，加8倍量的水浸泡90 min使透心，濾去藥材表面的水后，稱重并計(jì)算增加的質(zhì)量占總藥材質(zhì)量的比例，平行3次，經(jīng)計(jì)算吸水率為91.96%（n=3，RSD=1.0%）。因此，在后續(xù)浸泡時(shí)，按藥材吸水率補(bǔ)足加水總量。

2.1.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

選擇正交試驗(yàn)考察復(fù)方水提工藝，采用L9(34)正交試驗(yàn)表，對(duì)加水量（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）三個(gè)因素進(jìn)行考察，各因素水平設(shè)計(jì)見表1。稱取1倍處方量飲片，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，加水（補(bǔ)足吸水量）浸泡90 min，煎煮，過濾，合并提取液，離心（4 000 rpm，10 min）取上清液，結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)[5-9]，采用80℃減壓真空濃縮，濃縮液加蒸餾水定容至1 g生藥·mL-1，作為樣品溶液。用UV法測(cè)定君藥茶樹根有效成分原花青素、臣藥益母草有效成分總生物堿的含量，對(duì)原花青素含量、總生物堿含量、干膏得率三個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，得到復(fù)方最優(yōu)水提工藝。取最優(yōu)處方水提工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

表1 因素水平表

2.2 顆粒劑成型工藝考察

參考有關(guān)文獻(xiàn)[10]，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以顆粒劑的成品率與外觀性狀為指標(biāo)，對(duì)稀釋劑的種類、用量以及粘合劑的濃度進(jìn)行考察。

2.2.1 稀釋劑考察

按最優(yōu)水提工藝提取該復(fù)方，于80℃減壓濃縮藥液濃度至約1 g生藥·mL-1，60℃真空干燥，粉碎，過100目篩，備用。取等質(zhì)量干浸膏粉若干份，加入不同比例的乳糖、可溶性淀粉或糊精等常用稀釋劑，再加入0.2 mL·g-1的乙醇溶液潤(rùn)濕與分散物料，加入0.2 mL·g-1的5%PVP乙醇溶液制軟材，以12目篩制粒。濕顆粒于60℃干燥1 h，以12目篩整粒，即得。

2.2.2 粘合劑考察

該復(fù)方浸膏粉易于吸濕，預(yù)實(shí)驗(yàn)表明乙醇溶液無法誘發(fā)干浸膏粉產(chǎn)生適合制軟材、制粒的適宜粘性，而采用5%PVP的乙醇溶液制粒效果較好。因此，對(duì)不同濃度的PVP乙醇溶液對(duì)軟材制備與顆粒成型性的影響進(jìn)行考察。取等質(zhì)量干浸膏粉3份，加入篩選的稀釋劑，加入0.2 mL·g-1的乙醇潤(rùn)濕物料，再分別加入0.2 mL·g-1的10%PVP乙醇溶液、5%PVP乙醇溶液及95%乙醇溶液作為粘合劑按照2.2.1中的方法制粒、干燥、整粒，即得。

2.3 顆粒劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3.1 含量測(cè)定方法

（1）原花青素的含量測(cè)定

取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品約5 mg，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲至完全溶解，加甲醇定容至刻度，搖勻得原花青素對(duì)照品溶液[11]。精密移取對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。以甲醇為空白對(duì)照，于280 nm處測(cè)吸光度A。以質(zhì)量濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為：

取樣品溶液適量，離心（4000 rpm，10 min），精密移取上清液0.15 mL，80℃水浴蒸干，精密加入5 mL甲醇，超聲20 min（功率250 W，頻率40 kHz），離心（4 000 rpm，10 min），取上清液用甲醇定容至50 mL，即得。以甲醇為空白對(duì)照，于280 nm處測(cè)吸光度A，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算復(fù)方中原花青素的含量。

分別取3批顆粒劑各約0.3 g，精密稱定，加入甲醇10 mL超聲20 min，離心（4 000 rpm，10 min），重復(fù)提取3次，合并上清液至50 mL容量瓶中，以甲醇定容，搖勻，精密吸取溶液1 mL，以甲醇定容至10 mL，即得供試品溶液。按照2.1.3項(xiàng)下的原花青素含量測(cè)定方法，測(cè)吸光度A，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算顆粒劑中原花青素含量。

（2）總生物堿的含量測(cè)定

益母草取鹽酸水蘇堿標(biāo)準(zhǔn)品約5 mg，精密稱定，置于10 mL棕色容量瓶中，加入0.1 mol·L-1的鹽酸溶液適量，超聲至溶解完全，繼續(xù)加入0.1 mol·L-1的鹽酸溶液至刻度線，搖勻，得鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液[11]。精密加入對(duì)照品溶液0，0.2，0.4，0.8，1.6，2.4 mL置于25 mL容量瓶，再依次精密加入2%硫氰酸鉻銨溶液3 mL，以0.1 mol·L-1的鹽酸溶液定容至刻度線，搖勻，置暗處冰浴1 h，濾過，取續(xù)濾液，以0.1 mol·L-1的鹽酸溶液為空白，在525 nm處測(cè)定吸光度。以空白試劑吸光度減去各對(duì)照品溶液的吸光度得△A，以質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，△A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為Y=2.9×10-3X-4.6× 10-3，r=0.9939，線性范圍0-56.064 μg·mL-1。精密移取樣品溶液1 mL至干燥蒸發(fā)皿中，80℃水浴蒸干，60℃真空干燥，得干膏。加入70%乙醇5 mL溶解干膏，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管內(nèi)，再以70%乙醇5 mL潤(rùn)洗蒸發(fā)皿并合并入離心管內(nèi)，超聲（功率250 W，頻率 40 kHz）提取20 min，離心（4 000 rpm，10 min），吸取上清液，向沉淀物中加入10 mL新鮮溶劑再重復(fù)提取2次。合并提取液，水浴蒸干，得殘?jiān)?。?0 mL的 0.1 mol·L-1的鹽酸溶液溶解殘?jiān)⑾礈烊萜鳎礈煲恨D(zhuǎn)入25 mL錐形瓶中，加入活性炭0.5 g，沸水浴30 min，冷卻至室溫，過濾至25 mL棕色容量瓶中。以少量 0.1 mol·L-1鹽酸溶液洗滌燒杯與濾器，洗滌液合并入容量瓶中。按上述方法測(cè)定吸光度并計(jì)算△A，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算復(fù)方中益母草總生物堿的含量。

2.3.2 薄層色譜鑒別

（1）三七藥材薄層色譜鑒別

取人參皂苷Rg1適量，加甲醇制制含人參皂苷Rg1濃度為1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。取三七對(duì)照藥材適量，加甲醇25 mL超聲15 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即得對(duì)照藥材溶液。取復(fù)方顆粒劑與缺三七陰性顆粒劑適量，同法制得供試品溶液與陰性樣品溶液。

分別取對(duì)照品溶液、藥材溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液2 μL，2 μL，8 μL，8 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置的下層溶液展開。待展開完全后取出。晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液（1→10），立即于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[13]。

（2）川芎藥材薄層色譜鑒別

取阿魏酸適量，加甲醇配制含阿魏酸1 mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。取川芎對(duì)照藥材適量，加0.1 mol·L-1的鹽酸溶液10 mL溶解，以乙醚提取3次，每次30 mL。合并乙醚層，蒸干，殘?jiān)右掖既芙獾脤?duì)照藥材溶液。取復(fù)方顆粒與缺川芎陰性顆粒劑，同法制得供試品溶液與陰性樣品溶液。

分別取上述四種溶液2 μL，4 μL，10 μL，10 μL，點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以苯-乙酸乙酯-甲酸（6∶1∶0.5）展開，展開完全后取出，晾干，置紫外光365 nm與254 nm下檢視[14]。

2.3.3 檢查

參照2015版《中國藥典》第四部通則（0104顆粒劑）項(xiàng)下的相關(guān)規(guī)定[15]，取3批復(fù)方顆粒劑分別進(jìn)行性狀、粒度、水分、溶化性等有關(guān)檢查。

3 結(jié)果與討論

3.1 復(fù)方的提取工藝

茶樹根為方中君藥，具有強(qiáng)心利尿、抗菌消炎、收斂止瀉的功效，臨床上用于治療風(fēng)濕性、高血壓性及肺原性心臟病，冠心病，心律不齊等疾病[16]。研究表明[17]，原花青素具有抗氧化和消除自由基的生理活性與抗高血壓、內(nèi)皮依賴性血管舒張活性、抗缺血-再灌注損傷等作用。益母草為臣藥，總生物堿是益母草抗心肌缺血的有效部位之一[18]。故將原花青素與總生物堿的含量作為水提工藝優(yōu)選的指標(biāo)。

該復(fù)方在臨床上以煎湯劑的形式服用，醇沉操作可能造成有效成分的損失，為保證與臨床使用方式一致，采用水提法進(jìn)行提取。本研究采用正交試驗(yàn)優(yōu)選水提工藝，采用單因素實(shí)驗(yàn)篩選制劑成型工藝，并采用綜合評(píng)分的方法以做出客觀、全面的評(píng)價(jià)。直觀分析結(jié)果見表2，方差分析見表3。

各因素對(duì)水提工藝的影響順序?yàn)镃＞B＞A，最佳工藝搭配為A2B2C2。其中因素B、C對(duì)提取效果有顯著性影響（P＜0.05），因素A對(duì)提取效果則無顯著性影響，見表3。結(jié)合生產(chǎn)成本考慮，確定最佳水提工藝為A1B2C2，即加8倍量水，提取2次，每次1.5 h。

取1倍處方量藥材共3份，按所優(yōu)選的水提工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，3批樣品中平均原花青素含量為21.81 mg·g-1（RSD=4.3%），平均總生物堿含量為345.36 μg·g-1（RSD=2.9%），平均干膏得率為17.25%（RSD=1.3%）。結(jié)果表明，所確定的提取工藝穩(wěn)定可行、重復(fù)性較好。

表2 正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果及極差分析

表3 正交試驗(yàn)方差分析表

3.2 顆粒劑的成型性考察

本方臨床用藥劑量較大，浸膏得率較高（17.25%），服用量較大（1倍處方得膏9.5 g），將其制成顆粒劑以外的劑型難度較大，因此將本方制成顆粒劑。中藥濕法制粒傳統(tǒng)的稀釋劑有糖粉、糊精、淀粉[19]，其中糖粉有明顯吸濕性，會(huì)干擾某些藥物成分，降低療效，而且使許多老年和糖尿病患者用藥受到限制[20]；淀粉水溶性較差，不適合作為顆粒劑的稀釋劑。而新開發(fā)的優(yōu)良稀釋劑乳糖、甘露醇、木糖醇等，由于其來源有限、價(jià)格較高等原因，目前使用還不太廣泛。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以乳糖和可溶性淀粉為稀釋劑制得的軟材過粘，顆粒吸濕性強(qiáng)，尤其是乳糖，所制顆粒明顯粘結(jié)成塊。根據(jù)表4中的1-3號(hào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用吸濕性小、可溶于熱水、價(jià)格低廉的玉米糊精作為稀釋劑；3-5號(hào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定干浸膏粉與糊精的最佳質(zhì)量比為1∶1。預(yù)試驗(yàn)確定潤(rùn)濕劑為0.2 mL·g-1的乙醇溶液，根據(jù)表4中5-7號(hào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定粘合劑為0.2 mL·g-1的5%PVP乙醇溶液。

表4 心脈通顆粒的成型工藝研究(n=2)

按照上述篩選結(jié)果，顆粒劑處方及制備工藝為：稱取1份糊精，加入1份浸膏粉，充分混合，加入0.2 mL·g-1的乙醇溶液潤(rùn)濕與分散物料，加入0.2 mL·g-1的5%PVP乙醇溶液制粒，60℃干燥1 h，以12目篩整粒，即得。

3.3 顆粒劑質(zhì)量評(píng)價(jià)

3.3.1 茶樹根中原花青素含量測(cè)定

以最優(yōu)工藝制備得的顆粒劑中的原花青素含量，結(jié)果見表5。

表5 心脈通顆粒中原花青素的含量(n=3)

3.3.2 三七與川芎藥材的薄層色譜鑒別

三七成分供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾，結(jié)果見圖1。川芎成分供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的藍(lán)色斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾，結(jié)果見圖2。

復(fù)方水提物不同于單味藥材，脂溶性成分含量少，其薄層鑒別如完全按照藥典中單味藥材的方法就有可能不能復(fù)現(xiàn)。由于薄層鑒別是為了確認(rèn)復(fù)方中的是否投入待鑒別藥材，因此使用藥材中專屬性較強(qiáng)的成分及對(duì)照藥材對(duì)復(fù)方顆粒進(jìn)行控制即可。2015版《中國藥典》在三七的薄層鑒別中采用的顯色劑為10%的硫酸水溶液，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該溶液粘度較低，霧化效果不佳；按照有關(guān)文獻(xiàn)更換顯色劑為（10%的硫酸乙醇溶液）與展開劑[氯仿-甲醇-水（13:7:2）10℃以下放置的下層溶液]后，顯色效果較好，斑點(diǎn)圓整清晰。2015版《中國藥典》在川芎的薄層鑒別中所使用的對(duì)照品為歐當(dāng)歸內(nèi)酯A，提取方法為乙醚回流提取，該成分在水提物中無法鑒別出。結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，改用0.1 mol·L-1鹽酸酸化后乙醚提取，使用對(duì)照品阿魏酸，能夠順利對(duì)水提物中的川芎藥材進(jìn)行鑒別。

圖1 在日光（A）和紫外光365 nm（B）條件下三七的薄層色譜圖

圖2 在紫外光365 nm（A）和254 nm（B）條件下川芎的薄層色譜圖

表6 心脈通顆粒檢查項(xiàng)結(jié)果(n=3)

3.3.3 檢查項(xiàng)

以最優(yōu)工藝制備得的顆粒劑的水分、溶化性、粒度等指標(biāo)均符合2015版《中國藥典》第四部通則項(xiàng)下的相關(guān)規(guī)定，結(jié)果見表6。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究，本文的臨床驗(yàn)方的最優(yōu)提取工藝為：取處方量藥材，加8倍量水（按吸水率補(bǔ)足吸水量），提取2次，每次提取1.5 h，過濾，合并水提液，于80℃濃縮，于60℃真空干燥，得干浸膏。將干浸膏粉碎，過100目篩，加入1份玉米糊精，充分混勻，加入0.2 mL·g-1的乙醇潤(rùn)濕，再加入0.2 mL·g-1的5%PVP乙醇溶液制粒，60℃干燥，12目篩整粒，即得。所得顆粒外觀較好，粒度、水分、溶化性均符合2015年版《中國藥典》第四部制劑通則有關(guān)規(guī)定。按照處方量計(jì)算，復(fù)方顆粒的服用劑量為18.78 g·天-1。

4 結(jié)論

本文將臨床治療冠心病心肌缺血的有效驗(yàn)方，通過水提工藝優(yōu)化、濕法制粒技術(shù)制備為顆粒劑，不僅解決了湯劑煎煮不便的問題，而且為后續(xù)動(dòng)物藥效試驗(yàn)提供了原料制備工藝，為顆粒劑處方及工藝參數(shù)的優(yōu)選、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究、穩(wěn)定性考察等提供前期研究數(shù)據(jù)，并為本復(fù)方后期的新藥研發(fā)提供借鑒。

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