頂花板凳果愈傷組織和芽誘導(dǎo)培養(yǎng)研究

張 萍，王 森，付國(guó)贊，蔣建林，唐 艷

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.河南林業(yè)職業(yè)學(xué)院園林系，河南 鄭州 471002）

頂花板凳果（Pachysandra terminalis Sieb.et Zucc.）也稱粉蕊黃楊（中國(guó)樹木分類學(xué)）或頂蕊三角咪（中國(guó)高等植物圖鑒）［1］。黃楊科板凳果屬常綠亞灌木，莖稍粗壯，下部根莖狀且布滿長(zhǎng)須狀不定根，上部直立。葉薄革質(zhì)，菱狀倒卵形，似簇生狀?；ㄐ蛩霠?，白色，頂生。果卵形，長(zhǎng)5～6 mm，花期為4～5月，產(chǎn)于甘肅、陜西、四川、湖北、浙江等地，日本也有分布［2］。生于海拔1 000～2 600 m山區(qū)雜林或溝谷，喜陰濕耐寒，呈零星團(tuán)塊狀分布［1］。

頂花板凳果是“陜西七藥”中的重要藥材之一，全草可入藥，味苦微辛，可作為治療老年慢性支氣管炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的復(fù)方藥［3］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)頂花板凳果的化學(xué)成分進(jìn)行了大量研究。1975年日本學(xué)者Kikuchi［4］首次從頂花板凳果中分離出的Pachysandra型孕甾烷甾體生物堿具有很好的抗腫瘤活性藥效。2000年美國(guó)學(xué)者Funayama S等［5］從頂花板凳果中分離得到一個(gè)新化合物pachysamine-E（19）。2014年，王嘯洋［6］從陜西產(chǎn)頂花板凳果中分離得到7個(gè)生物堿，包括3個(gè)新化合物：1α-6α，10β-dihydroxy-2，3，7，7，10α-pentamethyl-2-azabicyclo-［4，3，1］decan-9-one（38）、20α-dimethylamino-3β-senecioylamino-16β-hydroxy-pregn-5-ene（39）和 20α-dimethylamino-3βsenecioylamino-pregn-5-ene（40）。2016年，段宏泉［7］課題組從頂花板凳果中分離出9個(gè)新富貴草型生物堿（terminamines-K-S ）（42-50）。

頂花板凳果植株低矮，四季常青，生長(zhǎng)旺盛，競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)，吸收有害氣體能力強(qiáng)，免修剪，易管理，養(yǎng)護(hù)成本低，既可作為園林綠化地被植物，又可作室內(nèi)盆栽觀賞植物，目前在江蘇、北京、上海等地已有引種開發(fā)利用［8］。嚴(yán)海燕［9］研究表明，頂花板凳果具有耐陰性較強(qiáng)、光適應(yīng)性范圍較廣且抵抗低溫寒冷的高度適應(yīng)性的生理生化功能。楊淑紅等［10］研究表明，林緣與林下交界處的BD2和BD4葉片中各種葉綠素含量均顯著高于其他葉片，證明頂花板凳果喜半陰環(huán)境，宜栽植在林緣、半林下、陰坡及建筑物北側(cè)半陰處，可與喬、灌木構(gòu)成復(fù)層次綠化，起到良好的水土保持作用。于洋等［11］研究表明，頂花板凳果耐旱性最強(qiáng)，夏季可耐15～20 d干旱。

頂花板凳果生產(chǎn)上常用播種繁殖、分株繁殖、切莖扦插繁殖、壓條繁殖［12］。王小平等［13］指出選沙質(zhì)壤土和或河沙作為基質(zhì)，6～7月間進(jìn)行扦插，當(dāng)年即可成為商品苗，經(jīng)濟(jì)效益高。但有關(guān)頂花板凳果的組織培養(yǎng)育苗少有報(bào)道，僅程水金等［14］研究富貴草（頂花板凳果）的離體快繁結(jié)果表明，小莖段在MS+6BA 5 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中分化率最高，在1/2 MS+NAA 0.1 mg/L的生根效果最好，但未對(duì)組織培養(yǎng)的具體條件做詳細(xì)探討。植物細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)是一種能滿足現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)需求的快速、便捷的繁殖方法［15］。本試驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討不同培養(yǎng)條件對(duì)頂花板凳果植物組織培養(yǎng)的影響，為頂花板凳果的組織培養(yǎng)育苗工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用2016年11月河南省洛陽市欒川縣赤土店熊耳山采挖栽植頂花板凳果的當(dāng)年生鮮嫩帶芽莖段。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同外植體采樣時(shí)間下的頂花板凳果組織培養(yǎng)情況測(cè)定 將在1月2日、3月3日、5月6日、6月2日采集的外植體，在同樣培養(yǎng)條件下進(jìn)行頂花板凳果愈傷組織和芽的誘導(dǎo)。每個(gè)處理30個(gè)樣本，3次重復(fù)。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行觀察記錄，統(tǒng)計(jì)外植體污染率、愈傷組織和芽的誘導(dǎo)率及生長(zhǎng)情況。

1.2.2 不同消毒方式下頂花板凳果組織培養(yǎng)情況測(cè)定 取當(dāng)年生鮮嫩帶芽頂花板凳果莖段，用軟毛刷輕輕刷洗莖部及腋芽處，用中性洗滌劑浸泡30 min，用流水沖洗4～6 h，置于無菌超凈工作臺(tái)上，備用。先用70%酒精消毒1 min，用無菌水沖洗3～4次，接著用滅菌劑浸泡，浸泡處理的時(shí)間按照單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行，設(shè)立3個(gè)不同處理：0.1% HgCl2處理5 min，4% 84消毒液處理0 min、0.1% HgCl2處理5 min，4% 84消毒液處理3 min、0.1% HgCl2處理5 min，4%84消毒液處理6 min，最后用無菌水沖洗6次，置于無菌濾紙上切成帶頂芽或腋芽的1～3 cm小莖段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種一個(gè)外植體。每個(gè)處理30個(gè)樣本，3次重復(fù)。后期觀察記錄試驗(yàn)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)外植體污染率、成活率和死亡率。

1.2.3 不同培養(yǎng)基下頂花板凳果組織培養(yǎng)情況測(cè)定 以MS為培養(yǎng)基，采用6-BA和NAA兩種植物生長(zhǎng)激素不同濃度處理的雙因素試驗(yàn)，共設(shè)置6組濃度處理：6-BA 1 mg/L + NAA 0.5 mg/L、6-BA 1 mg/L + NAA 1 mg/L、6-BA 2 mg/L+ NAA 0.5 mg/L、6-BA 2 mg/L + NAA 1 mg/L、6-BA 3 mg/L + NAA 0.5 mg/L、6-BA 3 mg/L +NAA 1 mg/L，然后附加蔗糖30 g/L、瓊脂5.2 g/L，pH調(diào)至5.8左右，每個(gè)處理30個(gè)樣本，3次重復(fù)［16］。培養(yǎng)45 d，觀察記錄，統(tǒng)計(jì)愈傷組織及芽的誘導(dǎo)率及生長(zhǎng)情況。

1.2.4 不同光照條件下頂花板凳果組織培養(yǎng)情況測(cè)定 接種后分別對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行光照培養(yǎng)和暗培養(yǎng)。光照強(qiáng)度1 000 lx，光照時(shí)數(shù)14 h/d。暗培養(yǎng)采用報(bào)紙完全遮蓋培養(yǎng)基，避光培養(yǎng)。2種處理均為靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25（±2）℃。接種2周后，每7 d進(jìn)行1次試驗(yàn)觀察，詳細(xì)記錄愈傷組織和芽的誘導(dǎo)情況，包括發(fā)生時(shí)間、顏色、質(zhì)地、生長(zhǎng)情況等。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采樣時(shí)間對(duì)頂花板凳果組織培養(yǎng)的影響

由表1可知，頂花板凳果外植體不同采樣時(shí)間情況下，其組織培養(yǎng)的誘導(dǎo)率、污染率及愈傷組織和芽誘導(dǎo)情況均有較大差異（圖1～圖4，封二）。5月是頂花板凳果外植體采樣的最佳時(shí)期，誘導(dǎo)率最高、為44%，污染率最低、為11%，且愈傷組織和芽的生長(zhǎng)狀況最好，萌動(dòng)和分化最明顯；6月相對(duì)5月植物誘導(dǎo)率降低，污染率升高，分別為20%、35%；1月的誘導(dǎo)率最低、為10%，污染率最高、為84%；3月相對(duì)1月外植體誘導(dǎo)率增大、為37%，污染率相對(duì)降低、為33%。

表1 不同外植體采樣時(shí)間對(duì)頂花板凳果組織培養(yǎng)的影響

2.2 不同外植體消毒方式對(duì)頂花板凳果組織培養(yǎng)的影響

由表2可知，0.1% HgCl2消毒5 min后再用4%84消毒液分別消毒0、3、6 min，隨著4% 84消毒液處理時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率逐漸降低，死亡率逐升高，但是污染率下降不明顯，死亡率差異較大，分別增加29、25個(gè)百分點(diǎn)，說明4% 84消毒液處理可達(dá)到消毒的效果，但其毒害作用也比較強(qiáng)，對(duì)外植體產(chǎn)生較大影響。因此，只用0.1% HgCl2處理5 min，是較好的外植體消毒方式。

表2 不同外植體消毒方式對(duì)頂花板凳果組織培養(yǎng)的影響

2.3 不同激素配比頂花板凳果組織培養(yǎng)的影響

生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素協(xié)同調(diào)控作用在植物組織培養(yǎng)中起到重要作用。研究結(jié)果表明，6個(gè)不同激素濃度配比培養(yǎng)基的頂花板凳果愈傷組織和芽的誘導(dǎo)率分別為16.7%、11%、47%、33%、27%、26.7%。其中6-BA 2 mg/L + NAA 0.5 mg/L處理的頂花板凳果愈傷組織和芽的誘導(dǎo)率最高、為47%。6-BA 1 mg/L + NAA 1 mg/L處理的頂花板凳果愈傷組織和芽的誘導(dǎo)率最低、為11%。當(dāng)6-BA濃度保持不變時(shí)，愈傷組織和芽的誘導(dǎo)率隨著NAA濃度的下降而下降；當(dāng)NAA濃度保持不變時(shí)，愈傷組織和芽的誘導(dǎo)率隨著6-BA濃度的增加呈先增加后下降的趨勢(shì)。

2.4 不同光照條件對(duì)頂花板凳果組織培養(yǎng)的影響

本研究結(jié)果表明，光照處理與黑暗處理對(duì)頂花板凳果愈傷組織和芽的誘導(dǎo)有明顯差異。接種后直接進(jìn)行光照培養(yǎng)，愈傷組織發(fā)生快，長(zhǎng)勢(shì)好，大部分為嫩綠色，質(zhì)地均勻蓬松，且出現(xiàn)較為明顯的芽的萌動(dòng)和分化，誘導(dǎo)率高達(dá)60%。接種后直接進(jìn)行暗培養(yǎng)則愈傷組織發(fā)生極慢，長(zhǎng)勢(shì)差，大部分都褐化死亡，誘導(dǎo)率僅為4%，愈傷組織均為黃綠色，且沒有明顯的芽萌動(dòng)和分化。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，在植物組織培養(yǎng)中，不同培養(yǎng)條件對(duì)組織培養(yǎng)的影響有較大差異。不同采樣時(shí)間、外植體不同消毒方式、不同激素配比、是否光照處理等因素對(duì)頂花板凳果愈傷組織和芽誘導(dǎo)均有不同影響。這些差異會(huì)導(dǎo)致外植體生理生化狀態(tài)差異，從而影響組織培養(yǎng)的形態(tài)建成。5月采集的當(dāng)年生健壯無病蟲害的幼嫩頂花板凳果帶芽莖段作為外植體，頂花板凳果愈傷組織和芽的誘導(dǎo)情況最佳。此時(shí)，愈傷組織出愈快、長(zhǎng)勢(shì)好、質(zhì)地均勻，芽有明顯的萌動(dòng)和分化?？赡艿脑蚴?月頂花板凳果春梢正處于大量萌發(fā)期，植物體內(nèi)積累內(nèi)源激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較高，且植物體內(nèi)的內(nèi)部狀態(tài)良好，因此愈傷組織和芽的誘導(dǎo)率較高［17-18］。1月外植體正處于休眠期，組織老化，生命力弱，故污染率高，且其新陳代謝緩慢，內(nèi)源激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相對(duì)缺乏，故誘導(dǎo)率也低。3月與6月采集的外植體誘導(dǎo)率和污染率均處于中間水平，原因可能是3月氣溫逐漸回暖，植物體的休眠逐漸解除，生命活力也漸漸恢復(fù)，抗菌抗病能力增強(qiáng)，故誘導(dǎo)率升高、污染率下降。6月相對(duì)5月外界溫度升高和濕度均增大，微生物大量滋生，且頂花板凳果莖段更粗壯，表面積增大，導(dǎo)致在采樣和組培操作時(shí)材料更易被污染。

外植體消毒是組織培養(yǎng)過程的至關(guān)重要環(huán)節(jié)，為防止污染發(fā)生，從選材和接種前準(zhǔn)備、接種及培養(yǎng)階段都投入了大量的人力、物力，既要保證外植體表面的微生物徹底被殺死，又要盡可能減少對(duì)外植體組織和表面細(xì)胞的傷害［19-20］。消毒藥劑濃度不能太低也不能太高，消毒時(shí)間不能太長(zhǎng)或太短，若殺菌劑濃度過高或消毒時(shí)間過長(zhǎng)，植物細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)自身的保護(hù)機(jī)智，不斷產(chǎn)生大量次生物質(zhì)，引起細(xì)胞毒害，產(chǎn)生褐化甚至死亡，導(dǎo)致外植體的死亡率增加［21］。本試驗(yàn)中，采用 0.1% HgCl2處理 5 min，而不用4% 84消毒液處理，就能達(dá)到較好的消毒效果，且死亡率相對(duì)較低。頂花板凳果外植體的消毒需要的時(shí)間較短，可能是材料在人工氣候培養(yǎng)室生長(zhǎng)，采集的外植體均較幼嫩，減少了和外界復(fù)雜環(huán)境的接觸，所以攜帶的雜菌也較少。隨著用4% 84消毒液處理時(shí)間的加長(zhǎng)，對(duì)外植體的毒害也相應(yīng)加深，外植體的活性也隨之降低，導(dǎo)致死亡率增高。

在離體培養(yǎng)過程中，外源激素的種類、濃度及其組合配比誘導(dǎo)不同植物材料的不定芽效果不同［22］。NAA屬于天然生長(zhǎng)素，合成比較穩(wěn)定的化合物，能促進(jìn)組培苗節(jié)間的伸長(zhǎng)［23］；6-BA是第一個(gè)人工合成的細(xì)胞分裂素，在植物形態(tài)發(fā)育中能促進(jìn)細(xì)胞分裂，利于愈傷組織的形態(tài)建成［24］，還能促進(jìn)芽分化、側(cè)芽生長(zhǎng)［25］。趙楊陽等［26］研究家獨(dú)行菜愈傷組織的叢生芽誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，6-BA作為主效植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，當(dāng)濃度為1.5 mg/L時(shí)誘導(dǎo)率高達(dá)89.9%，效果較好。誘導(dǎo)器官發(fā)生時(shí)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的配比至關(guān)重要，當(dāng)外植體中生長(zhǎng)素含量較高而細(xì)胞分裂素含量較低時(shí)，越有利于愈傷組織的誘導(dǎo)。吳秀燕等［27］研究發(fā)現(xiàn)，6-BA和NAA共同使用對(duì)美國(guó)流蘇莖段不定芽誘導(dǎo)效果較好，誘導(dǎo)率高達(dá)86.8%。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中加入激素6-BA濃度為2 mg/L、NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)，頂花板凳果愈傷組織和芽的誘導(dǎo)率最高，且愈傷組織和芽均有明顯萌動(dòng)，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，愈傷組織質(zhì)地均勻，呈嫩綠色。這與程水金等［14］研究結(jié)果不一致，可能是材料的來源不同及個(gè)體差異導(dǎo)致。

光作為一種物理因子影響外植體的脫分化、器官的發(fā)生和幼苗的形態(tài)建成及生長(zhǎng)發(fā)育過程。主要通過人工調(diào)控光強(qiáng)度、光質(zhì)、光周期等光環(huán)境因子，且考慮光與其他環(huán)境因子共同作用，來滿足植物生長(zhǎng)發(fā)育需要的光環(huán)境［28］。不同植物對(duì)光環(huán)境條件要求不一致，過高光強(qiáng)會(huì)抑制光合作用，導(dǎo)致光氧化，破壞光合作用器官；過低光強(qiáng)不利于植物的光合產(chǎn)物的積累和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)物的提高，因?yàn)槿豕鈱?dǎo)致植物消耗更多自身結(jié)構(gòu)物質(zhì)來擴(kuò)大光能接受面積及增加光系統(tǒng)組分的能量［29］。本研究中光照培養(yǎng)頂花板凳果的愈傷組織及芽的誘導(dǎo)率比暗培養(yǎng)高54%，說明頂花板凳果更適用于光照培養(yǎng)。

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