毛細管電泳法檢測飲料中的色素

陳林情， 楊 昆， 蘇安梅， 鐘青梅， 王益林*

(1.廣西生物煉制重點實驗室，廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧 530004；2 廣西出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，廣西南寧 530028)

食用色素是食品添加劑之一，依其來源，可分為天然食用色素和人工合成食用色素[1]兩大類。天然食用色素絕大部分來自植物組織，特別是水果和蔬菜，優(yōu)點是安全性高；缺點是成本高、保質(zhì)期短、著色力差。人工合成色素是指用人工化學(xué)方法合成所制得的有機色素，主要是以煤焦油中分離出來的苯胺染料為原料制成的。合成色素與天然色素相比，具有色澤鮮艷、著色力強、性質(zhì)穩(wěn)定和價格便宜等優(yōu)點；缺點是某些人工合成色素具有慢性毒性或致癌性。根據(jù)我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》(GB 2760-2011)規(guī)定，食品飲料中亮藍和日落黃的最大使用量為0.10 g/kg，莧菜紅為0.05 g/kg。目前，人工合成色素的主要檢測方法有高效液相色譜法[2 - 4]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5 - 7]、超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法[8 - 9]、薄層色譜法[10 - 11]及毛細管電泳法[12 - 13]等。

毛細管電泳法具有分離效率高、分離模式多樣及試劑和樣品消耗量少等優(yōu)點，適用于基體復(fù)雜的食品樣品中色素的分析檢測。本文采用毛細管電泳法同時測定飲料中日落黃、亮藍和莧菜紅三種色素。本方法不需要用到大量有機溶劑，具有分離度大、簡單快速、結(jié)果可靠等優(yōu)點。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

毛細管電泳儀(北京華陽利民儀器有限公司)，配紫外檢測器，色譜數(shù)據(jù)工作站(HW-2000通用版)；未涂層石英毛細管(50 cm×50 μm，有效長度41 cm，河北永年光纖廠)；PXSJ-216離子分析儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；KQ2200E超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；AL104電子天平(梅特洛-托利多儀器(上海)有限公司)；微孔濾膜(孔徑0.45 μm，津騰實驗設(shè)備有限公司)。

日落黃、亮藍、莧菜紅(阿拉丁化學(xué)試劑有限公司)，羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)(98%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，H3BO3、檸檬酸鈉(廣東汕頭寧化工廠)，Na2B4O7(重慶北碚化學(xué)試劑廠)，檸檬酸、Na2HPO4、NaH2PO4、無水醇(廣東光華科技股份有限公司)。所用試劑均為分析純，實驗用水為去離子水。

橙味汽水和葡萄飲料均購于南寧市某超市。

1.2 溶液配制

分別稱取亮藍、日落黃和莧菜紅各0.1250 g于100 mL燒杯中，用去離子水溶解并轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中定容到刻度，配制成500 mg/L的混合標準儲備溶液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用時再用去離子水稀釋至所需的混合標準工作液。

1.3 樣品預(yù)處理

將所測試樣品先超聲脫氣30 min，然后吸取經(jīng)超聲脫氣后的樣品10.0 mL于50 mL容量瓶中，用去離子水定容，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾兩次后，進樣檢測。

1.4 電泳條件

50 cm×50 μm(有效長度41 cm)石英毛細管，15 mmol/L H3BO3-Na2B4O7緩沖溶液(pH=10.0)，羥丙基-β-環(huán)糊精濃度為30 mmol/L，工作電壓17 kV，檢測波長220 nm，虹吸進樣高度10 cm，進樣時間20 s。毛細管每次進樣前分別用0.1 mol/L NaOH、去離子水及運行緩沖溶液沖洗10、10、30 min，相同濃度樣品每次進樣之間用運行緩沖溶液沖洗10 min，不同濃度樣品進樣之間用0.1 mol/L NaOH、去離子水及運行緩沖液分別沖洗10 min，實驗結(jié)束后毛細管用去離子水沖洗。

2 結(jié)果與討論

2.1 電泳分離條件的確定

2.1.1緩沖溶液及濃度的選擇相同實驗條件下，分別考察了NaH2PO4-NaOH、NaH2PO4-Na2HPO4、檸檬酸、檸檬酸鈉和H3BO3-Na2B4O7四種緩沖溶液對日落黃、亮藍和莧菜紅三種色素同時分離的影響。結(jié)果表明，在H3BO3-Na2B4O7緩沖液中，3種目標色素達到基線分離且穩(wěn)定，基線噪聲小，信噪比高，響應(yīng)值好。所以，實驗選擇在H3BO3-Na2B4O7緩沖溶液中進行3種色素的電泳分離。

實驗考察了濃度分別為10、15、20、25 mmol/L的H3BO3-Na2B4O7運行緩沖溶液對3種目標色素電泳行為的影響。實驗表明，隨著緩沖溶液濃度增大，目標物的響應(yīng)度、分離度和峰面積逐漸增強；同時遷移時間逐漸延長，峰形變寬。綜合考慮響應(yīng)度、峰形和遷移時間等，選擇緩沖溶液的濃度為15 mmol/L。

圖1 緩沖液pH值對合成食用色素毛細管電泳的影響Fig.1 Effects of buffers pH on capillary electrophoresis of synthetic food colorantsExperimental conditions：A:pH=10.5;B:pH=10.0;C:pH=9.5;D:pH=9.0.1.brilliant blue,2.sunset yellow,3.amaranth.

2.1.2緩沖溶液pH的選擇隨著pH值的增大，毛細管內(nèi)壁表面的硅羥基解離程度逐漸增大，其產(chǎn)生的電滲流(EOF)也逐漸增大，使得目標物的遷移時間縮短、遷移速度明顯加大。實驗考察了緩沖溶液pH分別為9、9.5、10、10.5時，3種色素(濃度150 mg/L)的分離情況。圖1表明，當(dāng)pH為10時，3個目標物能夠很好的達到基線分離，而且峰形對稱性好。所以，后續(xù)實驗選擇在pH=10.0的H3BO3-Na2B4O7緩沖液中進行。

2.1.3添加劑HP-β-CD濃度的選擇人工合成色素的著色能力很強，容易吸附在毛細管內(nèi)壁，因此會導(dǎo)致色素峰形差，表現(xiàn)為前伸和拖尾峰，峰響應(yīng)度低，從而影響實驗的靈敏度和重復(fù)性。我們選擇HP-β-CD來抑制被測物在毛細管內(nèi)壁的吸附。實驗考察了HP-β-CD濃度分別為10、20、30、40 mmol/L時，3種目標色素(濃度150 mg/L)的分離情況。從圖2可以看出，隨著HP-β-CD濃度的增大，檢測物的遷移時間延長，分離度也增大。綜合考慮，實驗選擇HP-β-CD的濃度為30 mmol/L。

2.1.4分離電壓的選擇在前述條件下，考察了運行電壓分別為13、15、17和19 kV時，3種目標色素(濃度150 mg/L)的遷移行為。結(jié)果表明，隨著電壓的升高，色素的遷移時間逐漸縮短。當(dāng)電壓從13 kV增大到17 kV時，色素的峰形隨著電壓的增大而變尖銳對稱，峰響應(yīng)效果好，且基線分離效果好；當(dāng)電壓為19 kV時，峰的響應(yīng)度低，基線分離穩(wěn)定性差，背景高。所以，實驗選擇17 kV作為最佳運行電壓。

圖3為最優(yōu)電泳條件下的電泳圖可以看出，3種色素的出峰順序為：亮藍、日落黃、莧菜紅。

圖2 緩沖液中添加劑HP-β -CD濃度對合成食用色素毛細管電泳的影響Fig.2 Effects of HP-β -CD concentration on capillary electrophoresis of synthetic food colorants.A:20 mmol/L;B:30 mmol/L;C:40 mmol/L;D:50 mmol/L.1.brilliant blue;2.sunset yellow;3.amaranth

圖3 最優(yōu)化條件下合成食用色素的毛細管電泳圖Fig.3 Capillary electrophoresis of synthetic food co-lorants under the optimal conditionsA：standard；B：amaranth；C：sunset yellow；D：brilliant blue.1：brilliant blue；2：sunset yellow；3：amaranth.

2.2 工作曲線

取不同體積的500 mg/L混合標準儲備溶液。用去離子水稀釋成不同濃度的混合標準工作液，在最優(yōu)條件下進行電泳實驗，并以色素的峰面積對濃度建立工作曲線。結(jié)果表明，3種色素的峰面積與其濃度在10～300 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)(R2)均在0.99以上。以3倍信噪比(S/N=3)為檢出限，所得結(jié)果見表1。

表1 3種色素的線性關(guān)系及檢出限Table 1 Regression equation and detection limit of three synthetic food colorants

2.3 樣品測定和加標回收率

橙味汽水和葡萄飲料2種樣品經(jīng)過預(yù)處理后，按1.4節(jié)的電泳條件進行檢測。根據(jù)出峰時間進行定性，由峰面積進行定量。測定結(jié)果表明，橙味汽水中只檢測到日落黃；葡萄飲料中只檢測到莧菜紅，具體含量見表2。結(jié)果表明，所測樣品中色素含量符合食品安全國家標準(GB 2760-2011)。2種色素的加標回收率在97.7%～104.5%之間，說明方法的準確度較高；相對標準偏差(RSD)小于1.69%，說明方法的重現(xiàn)性好。

表2 回收率測定結(jié)果(n=3)Table 2 The determination results of recovery(n=3)

3 結(jié)論

建立了毛細管電泳-紫外檢測法測定飲料中色素的分析方法，并測定了橙味汽水、葡萄飲料等2種飲料中色素的含量。結(jié)果表明，回收率在97.7%～104.5%之間，多次測定結(jié)果的相對標準偏差小于1.69%。該方法簡便可靠，可用于對市售飲料中色素進行質(zhì)量控制。

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