柱前衍生高效毛細(xì)管電泳法分析不同黃酒的多糖組成

陳傳平,陳乃東,陳紅風(fēng)

(1.皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院,安徽六安 237005; 2.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院,安徽六安 237012)

黃酒,也稱為米酒,是我國歷史最悠久的傳統(tǒng)釀造酒,也是世界三大古酒之一。黃酒的酒體豐滿,酒味醇厚,酒性柔順,并以其美妙的色澤、獨(dú)特的滋味、豐富的營養(yǎng)和獨(dú)到的保健功能而著稱于世[1]。研究表明,黃酒中含有很多生物活性物質(zhì),其中的糖類是形成其獨(dú)特的滋味及保健功能的重要成分之一[2-3]。黃酒中的糖類大部分是葡萄糖,還有一定量的果糖、低聚糖及多糖[4]。其中低聚糖、多糖[5]可以被腸道內(nèi)的有益菌所利用,起到優(yōu)化體內(nèi)環(huán)境,調(diào)節(jié)胃腸道機(jī)能[6],促進(jìn)維生素合成和礦物質(zhì)吸收[7]的作用,黃酒多糖還有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫的活性[8]。近年來對黃酒的相關(guān)研究大多集中于理化檢測和發(fā)酵工藝等方面,對黃酒的生理功效和活性物質(zhì)研究還停留在起步階段,因此很有必要借助現(xiàn)代科學(xué)研究方法對其進(jìn)行系統(tǒng)、深入的探究[9]。

HPCE分析法操作方便、精度高,同時(shí)可從圖譜上直觀的確定多糖的單糖組成及比例。為了深入探討黃酒的多糖組成,同時(shí)為黃酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的構(gòu)建提供理論依據(jù),本實(shí)驗(yàn)選用3種類型黃酒為測試對象,分離其中多糖,用蒽酮-硫酸法測其多糖含量,通過采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化-高效毛細(xì)管電泳(HPCE)法檢測其中多糖的單糖組成,并加以比較分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丹陽黃酒5年陳 甜型黃酒,江蘇丹陽酒廠,批號:20161012;太湖之星1878 甜型黃酒,江蘇張家港釀酒有限公司,批號:20160916;中糧清潤3年陳 半甜型黃酒,中糧紹興酒有限公司,批號:20160925;女兒紅 半甜型黃酒,紹興女兒紅釀酒有限公司,批號:20160923;和酒5年陳 半干型黃酒,上海石庫門釀酒有限公司,批號:20161014;金楓花雕3年陳 半干型黃酒,上海金楓酒業(yè)有限公司,批號:20161026;上海老酒8年陳 半干型黃酒,上海石庫門釀酒有限公司,批號:20160728;沙洲優(yōu)黃紫醉金迷 半干型黃酒,江蘇張家港釀酒有限公司,批號:20160820;中糧工坊12年陳 半干型黃酒,中糧紹興酒有限公司,批號:20160629;孔乙己清爽型 半干型黃酒,中糧紹興酒有限公司,批號:20160923;單糖標(biāo)準(zhǔn)品:D-(+)-半乳糖(批號:ZY130922)、D-甘露糖(批號:ZY130910)、D-(+)-葡萄糖(批號:ZY130915)、D-果糖(批號:ZY130910)、L-(+)鼠李糖(批號:ZY130915) 上海紫一試劑廠;D-(+)-半乳糖醛酸(批號:BCBK3704V)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP) SIGMA試劑公司;乙腈 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所,色譜純;三氟乙酸(TFA) 成都西亞化工股份有限公司,色譜純;聚酰胺 60～100目,山東君鴻生物科技有限公司;其余試劑均為AR。

HPCE電泳儀 凱奧科技發(fā)展有限公司;高速冷凍離心機(jī) 國立實(shí)驗(yàn)設(shè)備研究所;雙光束紫外可見分光光度計(jì) 普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃酒多糖的提取與純化 取每種黃酒各250 mL,14000 r/min冷凍離心5 min,減壓蒸發(fā)至30 mL左右,上聚酰胺柱純化(聚酰胺使用前在90 ℃的95%乙醇沸騰活化3次),上樣后先以去離子水洗脫至洗脫液呈現(xiàn)明顯顏色,再用無水乙醇沖聚酰胺柱,分別收集水洗脫液、醇洗脫液,冷凍干燥,稱重,編號,冷藏備用。

1.2.2 黃酒多糖的含量測定 精密稱取醇洗部分凍干粉末1.0 mg,溶于5 mL去離子水,以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,蒽酮-硫酸比色法[10]測定醇洗部分凍干粉末中多糖的含量,計(jì)算出黃酒中多糖的含量。

多糖含量(%)=D·E·F·V/W×100

式中，W為黃酒樣品質(zhì)量(mg);E為黃酒樣品中葡萄糖濃度(mg/mL);D為稀釋因素；F為換算因子；V為黃酒樣品體積(mL)。

1.2.3 不同黃酒的多糖組成分析

1.2.3.1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精確稱取6種單糖標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg,置于5 mL的具塞試管中,加入1.0 mL的去離子水,再依次加入0.3 mol/L的NaOH 1.0 mL、0.5 mol/L的PMP 1.0 mL,塞上瓶塞并固定,混勻,置70 ℃水浴30 min后取出,自然冷卻后滴加0.3 mol/L HCl 1.0 mL中和,轉(zhuǎn)入燒杯,100 ℃烘干后加入2.5 mL的去離子水復(fù)溶,滴加0.3 mol/L HCl至pH5.0,用2.5 mL四氯甲烷反應(yīng),再加2.5 mL氯仿萃取3次,水相-50 ℃冷凍干燥至恒重,殘?jiān)铀芙?分別配制成0.1、0.25、0.5、0.75、1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,0.45 μm微孔濾膜過濾,HPCE分析,對峰面積和濃度進(jìn)行線性回歸分析,得回歸方程(標(biāo)準(zhǔn)曲線)[11]。

1.2.3.2 多糖的酸解及柱前衍生化 準(zhǔn)確稱取10種黃酒多糖(醇洗部分凍干粉末)各20 mg,置于5 mL的具塞試管中,分別滴加2 mL的0.05 mol/L的TFA,搖勻,塞上塞子,在110 ℃、103 kPa高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)反應(yīng)5 h,冷卻后轉(zhuǎn)入燒杯中,100 ℃烘干[12-13]。再用1.2.3.1同法衍生化,測定黃酒多糖的單糖組成。

1.2.3.3 電泳條件 經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn),確定檢測黃酒多糖中單糖的電泳條件為:350 mmol/L的硼酸的溶液(pH10.8),檢測電壓20 kV,紫外檢測波長250 nm,石英的毛細(xì)管柱50 μm×100 cm,柱溫25 ℃,壓力進(jìn)樣時(shí)間10 s[14-15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組內(nèi)前后比較用配對t檢驗(yàn),組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。檢驗(yàn)結(jié)果以p<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同黃酒多糖的含量

由實(shí)驗(yàn)測得的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1,以葡萄糖濃度(C)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為A=10.222C-0.0346,決定系數(shù)R2=0.9936,線性范圍0.0l～0.08 mg/mL。

圖1 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The working curve of glucose solution

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,用同樣操作方法測定黃酒多糖的含量。3種類型黃酒樣品多糖的含量測定結(jié)果見表1。

表1 3種類型黃酒樣品多糖含量Table 1 The polysaccharide content of 3 kinds of yellow rice

表1表明:甜型黃酒丹陽黃酒5年陳中多糖含量為0.0361%,太湖之星1878為0.2412%,兩者差異極顯著(p<0.01)。半甜型黃酒中,中糧清潤3年陳多糖含量為0.1463%,女兒紅黃酒為0.1457%,兩者無顯著性差異(p>0.05)。6種半干型黃酒中,金楓花雕3年陳多糖含量最高,為0.1644%,上海老酒8年陳最低,為0.0182%,兩種黃酒與同型其他四種黃酒相比,均差異顯著(p<0.05);和酒5年陳與沙洲優(yōu)黃紫醉金迷、中糧工坊12年陳與孔乙己清爽型多糖含量均無顯著性差異(p>0.05)。已有報(bào)道的保健酒中,“三七枸杞酒”多糖含量為0.0216%[16],“蟲草酒”多糖含量為0.0179%[17],干紅葡萄酒為0.0538%[18]等,10種黃酒除“上海老酒8年陳”外,多糖含量均高于以上幾種保健酒。

從黃酒類型看,半甜型黃酒多糖的平均含量最高,為0.1460%,其次是甜型黃酒0.1387%,半干型最低,為0.0654%,組間差異顯著(p<0.05)。有研究指出,黃酒的穩(wěn)定性是相對的,黃酒成分復(fù)雜,在貯存過程中,其理化指標(biāo)也隨之不斷改變,貯存溫度、光照、煎酒溫度和時(shí)間、酒精度、酸度和pH都對成品黃酒多糖的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響,黃酒在生產(chǎn)和貯存過程中擁有合理的理化指標(biāo)、適宜的煎酒溫度和時(shí)間、通風(fēng)、避光、適溫貯存,可以降低活性多糖的分解和損失,保證黃酒多糖的功能性和有效性[19],因此,黃酒多糖的含量可能與其釀造工藝及貯存條件等因素有關(guān)。

2.2 不同黃酒的多糖組成分析

2.2.1 6種單糖PMP衍生物的HPCE分離及標(biāo)準(zhǔn)曲線 6種單糖PMP衍生物混合溶液進(jìn)行HPCE,得到較好的分離,結(jié)果見圖2?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)液中各單糖PMP衍生物的流出順序及保留時(shí)間依次為PMP 19.450 min、葡萄糖20.332 min、甘露糖21.433 min、鼠李糖22.018 min、果糖22.542 min、半乳糖24.433 min、半乳糖醛酸28.579 min,6種單糖的濃度與峰面積的回歸方程如表2所示,其相關(guān)系數(shù)為0.9953～0.9987。

圖2 6種單糖的電泳分離圖譜Fig.2 The HPCE chromatogragh of the six standard monosaccharides注:0:PMP;1:葡萄糖;2:甘露糖; 3:鼠李糖;4:果糖;5:半乳糖;6:半乳糖醛酸。

表2 6種單糖電泳標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程與相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear equation and correlation coefficient of 6 kinds of standard curves of monosaccharides electrophoresis

2.2.2 10種黃酒多糖單糖組成的HPCE分析 10種黃酒多糖單糖組成的HPCE分析圖譜見圖3。從檢測結(jié)果中可以看出,不同種的黃酒多糖的單糖種類有所不相同。其中,甜型黃酒的丹陽黃酒5年陳及太湖之星1878、半干型黃酒的和酒5年陳及上海老酒8年陳有2個(gè)單糖衍生物色譜峰;其余6種僅有1個(gè)單糖衍生物色譜峰。根據(jù)單糖混標(biāo)色譜圖(圖2)與不同黃酒多糖色譜圖的出峰時(shí)間進(jìn)行指紋圖譜比較得出:丹陽黃酒5年陳、和酒5年陳和上海老酒8年陳的2個(gè)單糖衍生物色譜峰為葡萄糖色譜峰和甘露糖色譜峰;太湖之星1878的2個(gè)單糖衍生物色譜峰為葡萄糖色譜峰和果糖色譜峰;其余6種含有的1個(gè)單糖衍生物色譜峰為葡萄糖色譜峰。因此,10種黃酒多糖中,丹陽黃酒5年陳、和酒5年陳和上海老酒8年陳含有葡萄糖和甘露糖,太湖之星1878含有葡萄糖和果糖,其余6種含只有葡萄糖。與張艷芳等[20]報(bào)道的“赤霞珠”干紅葡萄酒中多糖的單糖分析相比,10種黃酒多糖的單糖組成種類較少。同樣,從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,黃酒多糖的單糖組成與黃酒類型無相關(guān)性。

圖3 10種黃酒多糖的單糖HPCE圖譜Fig.3 Monosaccharide HPCE spectra of 10 yellow rice wine polysaccharides

2.2.3 10種黃酒多糖的單糖組成比例分析 通過HPCE得到的10種黃酒多糖的單糖組成圖譜與圖1對比,可知其多糖的單糖組成成分很接近。三種類型黃酒多糖中除主要含有葡萄糖外,甜型黃酒的“丹陽黃酒5年陳”還含有3.85%的甘露糖,“太湖之星1878”含有17.833%的果糖;半干型中的“和酒5年陳”及“上海老酒8年陳”分別含有1.64%及14.578%的甘露糖。報(bào)道指出,葡萄酒中的多糖來源于葡萄漿果、酵母以及感染灰霉病的葡萄漿果由灰霉菌分泌的糖苷[21],形成多糖的多樣性,不同黃酒多糖的單糖組成也可能與其不同的釀造原料、配方及工藝等因素有關(guān)。

表3 10種黃酒多糖中單糖的組成及其含量Table 3 Compositions and content of monosaccharide in the 10 kinds of rice wine polysaccharides

3 結(jié)論

不同類型及不同品種的黃酒多糖含量有明顯差異,其多糖的單糖組成也有所不同。甜型黃酒多糖含量為0.0361%～0.2412%,平均含量為0.1387%;半甜型黃酒多糖含量為0.1457%～0.1463%,平均含量0.1460%;半干型黃酒多糖含量為0.0182%～0.1644%,平均含量0.0654%。10個(gè)品種中,“太湖之星1878”中多糖含量可達(dá)0.2412%,“上海老酒8年陳”僅為0.0183%,但大部分黃酒的多糖含量均高于其他保健酒。黃酒多糖的單糖組成以葡萄糖為主,部分含有少量的甘露糖及果糖。黃酒多糖含量及單糖組成可能與其釀造工藝及貯存條件有關(guān),因此,尚需進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)態(tài)跟蹤研究。

本實(shí)驗(yàn)從黃酒中提取多糖用柱前衍生化的方法,再采用HPCE技術(shù)進(jìn)行分析,測定結(jié)果可為不同黃酒多糖的組成及其含量的測定提供參考依據(jù),也助于加深對黃酒營養(yǎng)保健功效的認(rèn)識(shí),為黃酒的生產(chǎn)工藝控制和新品研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

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