超聲波輔助復合酶法酶解木薯淀粉工藝優(yōu)化

任歡歡,楊曉宇,梁曉娟,陳澤林,馬 花,張 繼,*

(1.西北師范大學生命科學學院,甘肅蘭州 730070; 2.甘肅特色植物有效成分制品工程技術研究中心,甘肅蘭州 730070)

木薯(ManihotesculentaCrantz),多年生植物,廣泛栽培于熱帶和亞熱帶地區(qū),塊根含淀粉量達25%～35%,有地下糧倉之稱[1],在我國華南地區(qū)已大面積種植,以廣西、廣東和海南最多[2],在食品、藥品、化妝品及燃料生產方面呈現(xiàn)廣泛的應用前景[3-5]。木薯產量高,有很強的適應性,可在荒山、荒坡及鹽堿地等貧瘠土壤生長,在我國具有很大的潛在種植面積,這為食品及其他行業(yè)提供大量原料[6-8]。

工業(yè)上把淀粉水解轉變?yōu)橛坞x葡萄糖的過程稱為糖化或轉化[9],糖化是發(fā)酵行業(yè)的重要步驟之一,糖化液的品質決定了后續(xù)發(fā)酵過程中是否有足夠的可發(fā)酵糖類[10]。比較常用的淀粉糖化工藝主要包括3種:酸法、酶法和酸酶結合法。采用酸法水解會伴隨葡萄糖的復合和分解反應發(fā)生,對產品的純度有一定的影響,其純化過程也很復雜;使用酶法則可有效提高產量,降低成本,且能獲得較高純度的產品[11]。超聲波產生的空化效應可促進酶與木薯淀粉充分混合[12],克服了單純酶解浸出時間長、浸出溫度高、有效成分受熱過程長、雜質浸出多、能源消耗大等缺陷,從而提高了木薯淀粉糖化的經濟效益[13]。

本文通過超聲波細胞粉碎機對木薯淀粉進行預處理,采用耐高溫α-淀粉酶和糖化酶協(xié)同對木薯淀粉進行酶解,解決了產物糖化率較低的問題。并進一步用SEM、FT-IR、GC-MS等測試手段對木薯淀粉糖化前后的物質進行了分析,旨在為以木薯淀粉為原料的發(fā)酵工業(yè)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木薯淀粉 廣西紅楓淀粉有限公司;檸檬酸 天津市福晨化學試劑廠;酒石酸鉀鈉 宜興化學試劑廠;苯酚 煙臺市雙雙化工有限公司;3,5-二硝基水楊酸(DNS)、磷酸氫二鈉 上海中秦化學試劑有限公司;無水亞硫酸鈉 上海硫酸廠;耐高溫α-淀粉酶(酶活力2萬U/g)、糖化酶(酶活力10萬U/g) 北京沃比森科技有限公司；葡萄糖標準品 阿拉丁試劑有限公司。

HSY2-SP恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司;JD500-3電子天平 沈陽龍騰電子有限公司;C21-SDHCB66T蘇泊爾超薄電磁爐 浙江蘇泊爾股份有限公司;UV1000紫外可見分光光度計 北京萊伯泰科儀器股份有限公司;DHG-9143B5電熱恒溫鼓風干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;Scientz-4D杯式超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;Nicolet iS10傅立葉變換紅外光譜儀 Thermo Fisher Scientific;HITACHI S-450掃描電子顯微鏡 日本日立公司;氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 Thermo Fisher Scientific。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲波協(xié)同復合酶解木薯淀粉實驗設計 取30 g木薯淀粉，添加一定的蒸餾水，攪勻，在一定的功率下超聲處理一定時間后添加一定的耐高溫α-淀粉酶，再將其置于90 ℃水浴鍋中保溫40 min進行液化，取出后加入一定的糖化酶，調pH到定值，再將其置于一定溫度的水浴鍋中加熱一定時間，取出后待其冷卻至室溫后用SBA-40D生物傳感分析儀測其葡萄糖含量，計算其DE值。SEM、FT-IR、GC-MS的表征方法則在1.2.5、1.2.6、1.2.7中有詳細的描述。實驗設計如圖1所示。

圖1 木薯淀粉糖化實驗設計圖Fig.1 Experimental design of cassava starch saccharification

1.2.2 單因素實驗 考慮到實驗的可操控性,木薯淀粉液化條件參考郝曉敏等[14]的實驗條件略作修改(耐高溫α-淀粉酶添加量120 U/mL淀粉乳,液化溫度90 ℃,液化pH6.0,液化時間40 min);以超聲時間15 min、超聲功率800 W、糖化時間100 min、糖化溫度65 ℃、糖化酶添加量5 g/L、pH5.0、料液比9∶20 (g/mL)作為單因實驗的基礎條件,研究超聲時間(0、5、15、20、25、30 min)、超聲功率(0、300、600、900、1200、1500、1800 W)、糖化時間(70、80、90、100、110、120、130 min)、糖化溫度(50、55、60、65、70、75、80 ℃)、糖化酶添加量(2、3、4、5、6、7、8 g/L)、糖化pH(2、3、4、5、6、7、8)、料液比(3∶20、4∶20、5∶20、6∶20、7∶20、8∶20、9∶20、10∶20、11∶20 (g/mL))對DE值的影響。

1.2.3 響應面實驗 在單因素實驗結果的基礎上,選取影響木薯淀粉糖化的主要因素糖化時間、糖化溫度、糖化酶添加量以及糖化pH為考察變量,選取DE值為評價指標,采用Design Expert 8.0.6設計實驗,實驗因素水平表見表1。

表1 響應面實驗因素水平Table 1 Levels and code of response surface experiment

1.2.4 DE值的測定 還原糖含量的測定方法在樊曉輝[15]、楊貴明[16]的測定方法上略作修改:取待測糖化液0.5 mL,加pH4.8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液1.5 mL,DNS試劑3 mL,沸水浴7 min,快速冷卻后加蒸餾水5 mL,在530 nm處測其吸光值,采用蒸餾水作為對照組。以葡萄糖為標樣,制作標準曲線,所得標準曲線方程為Y=1.5312X+0.0080(R2=0.9992),式中:Y為OD值,X為葡萄糖濃度。DE值的計算方法如下:

1.2.5 掃描電子顯微鏡(SEM)對木薯淀粉顆粒超聲前后的觀察 樣品的處理借鑒郝曉敏等[14]的方法:取少量經冷凍干燥處理過的樣品置于樣品臺的雙面膠上,涂抹均勻,用吸耳球將樣品輕吹成單層,放在表面處理機中鍍金,取出后用掃描電子顯微鏡在25 kV超高電壓、真空條件和放大3200倍下觀察木薯淀粉超聲處理前后的形貌變化。

1.2.6 FT-IR對木薯淀粉的檢測 溴化鉀壓片法[17],波數(shù)范圍4000～400 cm-1,掃描累加16次,分辨率為4 cm-1。

1.2.7 GC-MS對木薯淀粉糖化液中單糖組成的分析 樣品的水解:精確稱取干燥至恒重的木薯淀粉、葡萄糖標準品及制得的木薯淀粉糖化產物各10 mg依次置于三個50 mL反應瓶中,再分別加入4 mL三氟乙酸溶液(TFA)(4 mol/L),120 ℃下氮氣保護水解8 h,室溫冷卻后,減壓除去TFA。

水解產物的衍生化:將除去TFA的三組樣品各加入10 mg鹽酸羥胺和1 mL吡啶,于90 ℃氮氣保護反應30 min,反應液冷卻至室溫后,分別加入1 mL乙酸酐,90 ℃下氮氣保護繼續(xù)反應30 min,進行乙?；苌锏闹苽?。待反應冷卻至室溫后,減壓蒸干,各加1 mL氯仿溶解,取1 μL進行GC-MS分析[18]。

GC-MS分析:采用GC-MS氣質聯(lián)用儀,配備DB-5MS UI毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。氣相色譜條件:載氣為高純氦氣;進樣口溫度250 ℃;程序升溫,起始溫度160 ℃,保持3 min,以2 ℃/min升至210 ℃,保持1 min;載氣流速1.0 mL/min,不分流速,進樣量1 μL。質譜條件:接口溫度250 ℃;離子阱溫度:150 ℃;電離方式:EI;電子轟擊能量:70 eV;溶劑延長時間:3 min;全掃描范圍:m/z 50～800;模式:選擇離子掃描(SIM)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每組實驗重復3次,實驗數(shù)據(jù)用Excel統(tǒng)計,采用SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,Origin 9.0繪圖軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 木薯淀粉糖化的單因素實驗

2.1.1 超聲時間對木薯淀粉糖化的影響 超聲波產生的機械作用和空化作用可以破壞木薯淀粉顆粒的結構,使酶等試劑更容易進入淀粉顆粒內部進行反應[19]。由圖2可知,超聲時間從0～30 min,DE值出現(xiàn)先增大后減小的變化規(guī)律,在超聲時間15 min時DE值達到最大。可能是在15 min的處理中,超聲作用使木薯淀粉的結晶結構受到破壞,淀粉顆粒出現(xiàn)更多的縫隙,使底物與酶等的接觸更加充分,促進了反應的進行,故DE值升高;15 min后,長時間的超聲作用使得抗酶解淀粉含量上升,淀粉的抗酶解能力提高[20],引起DE值降低。所以,在后續(xù)優(yōu)化實驗中,固定超聲時間為15 min。

圖2 超聲時間對木薯淀粉糖化的影響Fig.2 The effect of ultrasonic time on saccharification of cassava starch

2.1.2 超聲功率對木薯淀粉糖化的影響 適宜功率的超聲處理能促進木薯淀粉糖化反應的進行,但超聲波功率過高,則會導致淀粉酶結構的快速降解[21],反而不利于糖化的進行。圖3顯示出,在0～1800 W內,隨超聲功率的增大,DE值呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,且在超聲功率為900 W時,DE值達到最大,最有利于糖化的進行?？赡苁?在0～900 W,低功率的超聲作用使木薯淀粉顆粒的結構得到適度破壞,促進了糖化的進行,因此DE值升高;在900～1800 W,過高的超聲功率破壞了淀粉酶的空間結構,抑制了酶的活性,對木薯淀粉的糖化產生了阻礙作用,所以DE值降低。故在后續(xù)優(yōu)化實驗中,為有利于木薯淀粉的糖化,將超聲功率確定為900 W。

圖3 超聲功率對木薯淀粉糖化的影響Fig.3 The effect of ultrasonic power on saccharification of scassava starch

2.1.3 糖化時間對木薯淀粉糖化的影響 木薯淀粉的糖化程度與糖化時間有很大的關系,糖化時間過短,糖化過程不完全;糖化時間過長,則會使糖化周期延長。由圖4可看出,從70～130 min,隨著糖化時間的變化,DE值不斷增大,在100 min達到最大;隨后DE值又逐漸減小?？赡茉蚴?在70～100 min,還原糖逐漸增多,DE值也逐漸增大;在100～130 min,由于糖化液中一部分葡萄糖重新結合生成異麥芽糖等復合糖類[22],造成產物中還原糖含量減少,引起DE值逐漸變小。所以糖化時間的適宜范圍為90～110 min。

圖4 糖化時間對木薯淀粉糖化的影響Fig.4 The effect of treatment time on saccharification of cassava starch

2.1.4 糖化溫度對木薯淀粉糖化的影響 溫度對酶不但有促進作用也有抑制作用:溫度過低,酶活性不高;溫度過高,會使酶失活。由圖5所示,從50～80 ℃,DE值隨糖化溫度呈先增大后減小的趨勢,在65 ℃達到最大值。引起該變化的可能原因是:在65 min之前,隨著溫度的升高,糖化酶的活性逐漸增強,使反應速率加快,引起DE值升高;到65～80 min時,越來越高的溫度反而使糖化酶的活性受到抑制,還原糖的生成速率也開始變慢,另外異麥芽糖等副產物的生成會造成部分還原糖的浪費,故DE值逐漸變小。因此,糖化溫度的適宜范圍為60～70 ℃。

圖5 糖化溫度對木薯淀粉糖化的影響Fig.5 The effect of temperature onsaccharification of cassava starch

2.1.5 糖化酶添加量對木薯淀粉糖化的影響 糖化酶能夠將木薯淀粉水解為葡萄糖,糖化酶添加量過多,則成本增加,且因生成復合糖類而降低糖化率;酶添加量過少,則糖化過程不徹底,達不到最佳糖化效果。由圖6可知:當糖化酶添加量從2 g/L升至8 g/L的過程中,DE值先增大,在5 g/L時達到最大,再增加糖化酶添加量,DE值反而下降?？赡苁窃?～5 g/L,隨糖化酶添加量的增加,還原糖的產量逐漸變多,在5 g/L時反應體系對糖化酶的需求量達到飽和,故DE值達到最大值;在5～8 g/L,糖化酶添加量趨于剩余,因生成復合糖類而降低糖化率,故DE值逐漸減小。所以,在后續(xù)優(yōu)化實驗中將糖化酶添加量的范圍選取為4～6 g/L。

圖6 糖化酶添加量對木薯淀粉糖化的影響Fig.6 The effect of enzymatic dosage on saccharification of cassava starch

2.1.6 糖化pH對木薯淀粉糖化的影響 pH過高或過低對糖化酶的活性都有明顯的影響。由圖7可知,pH從2～8,DE值出現(xiàn)先增大后變小的變化規(guī)律,pH在5時DE值達到最大。可能原因是:pH從2～5,糖化酶活性逐漸增強,還原糖越聚越多,引起DE值變大;pH從5～8,該變化逐漸偏堿性,糖化酶的活性逐漸降低,生成還原糖的速率也逐漸減慢,又由于生成副產物造成部分還原糖的損失,引起產物中還原糖含量減少,DE值變小。因此,在后續(xù)優(yōu)化實驗中將選取糖化pH為4～6。

圖7 糖化pH對木薯淀粉糖化的影響Fig.7 The effect of pH on saccharification of cassava starch

2.1.7 料液比對木薯淀粉糖化的影響 料液比越小,糖化越完全,但產物較少;料液比越高,則糖化過程不能完全進行,不但浪費原料,而且使生產成本增加。由圖8可明顯看出,DE值先逐漸增大,在料液比為9∶20 g/mL時趨于平行?？赡苁?料液比從3∶20～9∶20 (g/mL),隨著原料的增加,液化醪濃度增大,酶與底物接觸更徹底,引起DE值逐漸增大;料液比從10∶20 (g/mL)后,DE值增大的趨勢不明顯,考慮到料液比的濃度過大及糖化的效果,因此,以9∶20 (g/mL)作為優(yōu)化糖化工藝參數(shù)的料液比。

圖8 料液比對木薯淀粉糖化的影響Fig.8 The effect of solid-liquid ratio on saccharification of cassava starch

2.2 響應面法優(yōu)化木薯淀粉糖化工藝

2.2.1 Design Expert 8.0.6設計及實驗結果 以Design Expert 8.0.6的中心組合實驗設計原理和單因素實驗結果為實驗設計依據(jù),選取糖化時間、糖化溫度、糖化酶添加量以及糖化pH設計4因素3水平的響應面分析方法,對木薯淀粉糖化工藝參數(shù)進行優(yōu)化。設計及實驗結果見表2。

表2 響應面實驗設計結果Table 2 The response surface design of experimental results

2.2.2 回歸模型的建立與分析 表2實驗數(shù)據(jù)利用Design Expert 8.0.6軟件對其進行回歸分析,得回歸方程:

Y(%)=98.03-1.16A+1.05B+4.47C-5.33D-2.78AB-0.049AC-3.99AD+0.83BC-5.13BD-1.17CD-9.54A2-9.16B2-9.06C2-9.99D2

通過回歸模型分析響應面的回歸參數(shù)(表3)。由表3可以看出,模型p<0.0001,該模型極顯著;失擬項p=0.1218>0.05,失擬項不顯著;一次項(C、D)、二次項(A2、B2、C2、D2)、交互項(AD、BD)對木薯淀粉糖化的效果有極顯著影響；交互項AB對木薯淀粉糖化的效果有顯著影響。通過以上數(shù)據(jù)可以看出，該模型擬合程度良好,可以用此模型來描述各糖化條件與DE值之間的關系。

表3 模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

2.2.3 糖化工藝的響應曲面分析和優(yōu)化 在響應面分析中,若觀察某兩個因素同時對響應值的影響可借助降維分析,即在其他因素條件固定在零水平的情況下,觀察兩個因素對響應值的影響并得到影響的二次方程以及響應面圖和等高線圖。響應曲面圖能夠直觀的反映各因素對響應值的影響,當響應曲面坡度陡峭,說明響應值受變量交互作用明顯,反之,當響應曲面坡度平滑,則說明響應值受各個變量變化的影響小。等高線圖能直觀反映因素交互作用對響應值的影響,圓形表示因素間交互作用不明顯,橢圓形則表示交互作用顯著。根據(jù)木薯淀粉的DE值,考察糖化溫度、糖化時間、糖化酶添加量、糖化pH以及交互作用對木薯淀粉糖化的影響,如圖9～圖14所示。

由圖11、圖13可知,響應曲面陡峭,表明糖化溫度和糖化pH、糖化時間和糖化pH交互作用對DE值的影響極顯著;由圖9的響應曲面較陡峭，表明糖化溫度和糖化時間交互作用對DE值影響顯著。由圖10、圖12、圖14可知,響應曲面較平緩,表明糖化溫度和糖化酶添加量、糖化時間和糖化酶添加量、糖化酶添加量和糖化pH交互作用對DE值的影響不顯著；與表3中的方差分析一致。

圖9 糖化溫度和糖化時間對木薯淀粉糖化影響的響應曲面圖Fig.9 Response surface plotshowing mutual influences of reaction temperature and reaction time on saccharification of cassava starch

圖10 糖化溫度和糖化酶添加量對木薯淀粉糖化影響的響應曲面圖Fig.10 Response surface plotshowing mutual influences of reaction temperature and glucoamylase on saccharification of cassava starch

圖11 糖化溫度和糖化pH對木薯淀粉糖化影響的響應曲面圖Fig.11 Response surface plotshowing mutual influences of reaction temperature and pH on saccharification of cassava starch

圖12 糖化時間和糖化酶添加量對木薯淀粉糖化影響的響應曲面圖Fig.12 Response surface showing mutual influences of reaction time and glucoamylase on saccharification of cassava starch

圖13 糖化時間和糖化pH對木薯淀粉糖化影響的響應曲面圖Fig.13 Response surface plotshowing mutual influences of reaction time and pH on saccharification of cassava starch

圖14 糖化酶添加量和糖化pH對木薯淀粉糖化影響的響應曲面圖Fig.14 Response surface plotshowing mutual influences of glucoamylase and pH on saccharification of cassava starch

2.2.4 優(yōu)化提取參數(shù)和驗證模型 經分析得到最大響應值與其相對應的木薯淀粉糖化的最佳條件是:糖化溫度64.91 ℃,糖化時間101.63 min,糖化酶添加量5.27 g/L,糖化pH4.68。理論最佳糖化率為99.60%。為了檢驗響應面法的可行性,采用得到的最佳糖化條件進行木薯淀粉糖化的驗證實驗,同時考慮到實際操作和生產的便利,因此將木薯淀粉糖化的實驗條件修訂為:糖化溫度65 ℃,糖化時間100 min,糖化酶添加量5 g/L,糖化pH4.7。經過5次平行實驗,得到的實際糖化率為98.98%,表明經優(yōu)化后的工藝條件能夠較好地預測木薯淀粉糖化工藝。

2.3 掃描電子顯微鏡(SEM)對木薯淀粉顆粒超聲前后的觀察

掃描電子顯微鏡對了解淀粉顆粒外部形貌具有強大的優(yōu)勢。由于其具有試樣容易制作、不因樣品表面復雜程度均可看到鮮明立體感的影像的特點,所以被廣泛應用于淀粉表面結構研究方面[23]。

由圖15A可知,未經超聲處理的木薯淀粉顆粒呈圓球型和橢圓形,表面光滑,無凹陷,具有一定的規(guī)整度,符合淀粉顆粒的微觀形貌。由圖15B可知,經超聲波處理的木薯淀粉顆粒表面變得凹凸不平、出現(xiàn)凹陷,沒有一定的規(guī)整度。由兩組圖可以看出,木薯淀粉超聲前后有明顯的差異,這主要歸因于超聲作用對木薯淀粉顆粒表層結構的破壞。

圖15 未超聲處理(圖A)與超聲處理(圖B)的木薯淀粉SEM照片(3200×)Fig.15 SEM diagram of cassava starch without ultrasonic treatment(A)and ultrasonic treatment(B)(3200×)

2.4 FT-IR對木薯淀粉的檢測

由圖16可以看出,在3413.83 cm-1處有一個締合羥基(-OH)的強伸縮振動吸收峰;在2928.35 cm-1處有一個較強亞甲基(C-H)的對稱伸縮振動吸收峰,1408.44 cm-1處則為其變角振動吸收峰;而C-H的彎曲振動吸收峰在1636.82 cm-1出現(xiàn),幅度較強;在1154～1022 cm-1范圍內,由于C-O鍵具有較大的極性,其紅外吸收峰較強,故其吸收峰在1154.01 cm-1處出現(xiàn)。而1022 cm-1處的強吸收峰則說明了木薯淀粉具有吡喃型糖環(huán)。依據(jù)以上特征峰,可推斷木薯淀粉主要組成單糖為葡萄糖。

圖16 木薯淀粉的紅外光譜圖Fig.16 Infrared spectrum of cassava starch

2.5 GC-MS對糖化液中單糖組成的分析

在定性方面,GC-MS具有快速、特效的特點。借助GC-MS分析多糖,只需對樣品進行衍生化后即可進行測定。此方法快速、簡便、重現(xiàn)性好且穩(wěn)定可行,對分析樣品中的單糖組成具有明顯的優(yōu)勢[24]。

圖17是葡萄糖標品、木薯淀粉糖化液及木薯淀粉乙酰化衍生產物的GC-MS圖譜。通過與葡萄糖標品衍生化產物圖譜比對,確定木薯淀粉糖化液和木薯淀粉水解后的產物是葡萄糖,且成分單一。

圖17 葡萄糖標品、木薯淀粉糖化液及木薯淀粉水解衍生產物色譜圖Fig.17 Chromatograms of hydrolyzed derivative of the glucose standard,the cassava starch saccharification liquid and the cassava starch

3 結論

本實驗以木薯淀粉為原料,以超聲時間、超聲功率、糖化時間、糖化溫度、糖化酶添加量、糖化pH、料液比為研究因素進行單因素實驗,經響應面優(yōu)化并考慮到實際情況的可操控性,得到木薯淀粉糖化的最佳提取條件為:超聲時間15 min,超聲功率900 W,糖化溫度65 ℃,糖化時間100 min,糖化酶添加量5 g/L,糖化pH4.7,料液比9∶20 (g/mL)。經過5次平行實驗,得到的實際平均糖化率DE為98.98%;掃描電子顯微鏡(SEM)結果顯示,木薯淀粉超聲前(表面光滑、具有一定的規(guī)整度)后(表面凹凸不平、沒有一定規(guī)整度)的形貌有差異;運用GC-MS對木薯淀粉的單糖組分進行分析表明,本實驗條件下,木薯淀粉糖化后的產物為葡萄糖,且成分單一。

[1]羅振敏,吳頁寶,胡平華,等.木薯高產栽培技術[J].現(xiàn)代園藝,2009(10):45-46.

[2]黃春芳,朱玉連,莫虎明,等.不同預處理方法對木薯渣水解效果影響的研究[J].廣西大學學報:自然科學版,2013,38(2):408-414.

[3]方佳,濮文輝,張慧堅.國內外木薯產業(yè)發(fā)展近況[J].中國農學通報,2010,26(16):353-361.

[4]Jansson C,Westerbergh A,Zhang J,et al. Cassava,a potential biofuel crop in(the)People’s Republic of China[J]. Applied Energy,2009,86(Supplement 1):S95-S99.

[5]趙宗保,胡翠敏.能源微生物油脂技術進展[J].生物工程

學報,2011,27(3):427-435.

[6]朱德明,匡鈺,韓志萍,等.木薯酒精發(fā)酵工藝研究[J].南方農業(yè)學報,2008,39(4):470-473.

[7]Dai D,Hu Z Y,Pu G Q,et al. Energy efficiency and potentials of cassava fuel ethanol in Guangxi region of China.[J]. Energy Conversion and Management,2006,47(13-14):1686-1699.

[8]Yang H,Chen L,Yan Z,et al. Emergy analysis of cassava-based fuel ethanol in China[J]. Biomass and Bioenergy,2011,35(1):581-589.

[9]黎劍雄,盧超華,黎記榮,等.改進雙酶法葡萄糖工藝[J]. 發(fā)酵科技通訊,2002,31(2):15-16.

[10]劉家興,遲原龍,胡小飛,等.米酒釀造的糖化條件優(yōu)化[J].中國釀造,2014,33(10):18-21.

[11]Satyanarayana T,Noorwez S M,Kumar S,et al. Development of an ideal starch saccharification process using amylolytic enzymes from thermophiles[J]. Biochemical Society Transactions,2004,32(2):276-8.

[12]Chemat F,Zill-e-Huma,Khan M K. Applications of ultrasound in food technology:Processing,preservation and extraction[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2011,18(4):813-35.

[13]王葳,張紹志,陳光明. 功率超聲波在食品工藝中的應用[J]. 包裝與食品機械,2001,19(5):12-16.

[14]郝曉敏,谷長生,宋文東,等.耐高溫α-淀粉酶酶解木薯淀粉研究[J].糧食加工,2008,33(2):40-42.

[15]樊曉輝,趙春玲,張成軍,等.3,5-二硝基水楊酸法測定枸杞提取液中多糖的含量[J].食品研究與開發(fā),2014,35(21):77-80.

[16]楊貴明,蔣愛華,薛秋生.用DNS光度法測定還原糖的條件研究[J].安徽農業(yè)科學,2006,34(14):3258-3264.

[17]石振興,熊犍,葉君.FT-IR研究CMC、MCC對小麥淀粉的抗回生規(guī)[J].現(xiàn)代食品科技,2014(3):33-37.

[18]楊永晶,韓麗娟,索有瑞.樹莓多糖中單糖組成的GC-MS分析[J].分析實驗室,2015(6):688-691.

[19]藍平,陳阿明,李冬雪,等.超聲波作用對木薯淀粉化學反應性能的影響[J].食品科技,2012(3):246-250.

[20]趙奕玲,廖丹葵,張友全,等.超聲波對木薯淀粉性質及結構的影響[J].過程工程學報,2007,7(6):1138-1143.

[21]王振斌,趙帥,邵淑萍,等. 超聲波輔助淀粉雙酶水解技術及其機理[J]. 中國糧油學報,2014,29(5):42-47.

[22]顧香玉,張曉云,劉景順.玉米微孔淀粉的制備及顯微結構研究[J].食品科學,2006,27(12):241-245.

[23]鄧永智,李文權,袁東星.海水小球藻中多糖的提取及其單糖組成的氣相色譜-質譜分析[J].分析化學,2006,34(12):1697-1701.

[24]梁軍,王迪,夏永剛,等.麻黃根多糖中單糖組成的GC-MS分析[J].中醫(yī)藥學報,2014(4):17-18.