一氧化氮對低溫貯藏桃果實線粒體氧化損傷的影響

胡珊，葉志恒，馮建榮，朱樹華

(1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系/特色果樹栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團重點實驗室，新疆石河子 832003；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院， 山東泰安 271018)

0 引 言

【研究意義】桃(Prunuspersica)屬于溫敏性水果，低溫貯藏下易發(fā)生冷害[1]。冷害會使果實發(fā)生生理癥狀的改變，比如增加果實重量的損失以及膜完整性的喪失[2]。冷害會使果實產(chǎn)生明顯病變癥狀，比如果肉褐變、不能正常后熟以及腐爛加快等[2, 3]。線粒體是細胞中供應(yīng)能量的主要場所。線粒體參與細胞分化、信息傳遞及細胞凋亡等過程，且具有調(diào)控細胞生長及細胞周期的能力[4]。線粒體數(shù)量和形態(tài)反映了細胞類型的能量需求?；钚匝?reactive oxygen species, ROS)是線粒體大量呼吸產(chǎn)生的[5]。不同的ROS含量在細胞內(nèi)有著不同的作用，線粒體內(nèi)膜脂過氧化程度的增加是由于線粒體ROS含量高會產(chǎn)生過多的氧化脂質(zhì)[6]。線粒體內(nèi)存在很多抗氧化酶，可以分解線粒體內(nèi)的ROS，維持線粒體內(nèi)的氧化還原平衡，減輕線粒體內(nèi)氧化損傷[7]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)轉(zhuǎn)性催化O2-，將其轉(zhuǎn)化成H2O和O2，是線粒體內(nèi)抵抗ROS的第一道防線[8]。過氧化氫酶(catalase, CAT)將線粒體內(nèi)的H2O2轉(zhuǎn)化為H2O 。過氧化物酶(peroxidase, POD)可以催化H2O2及過氧化脂類的分解[11, 12]。 線粒體抗氧化酶彼此間的協(xié)同作用可以清除線粒體內(nèi)多余的ROS，維持線粒體內(nèi)氧化還原的平衡[13]，而保證線粒體正常生理活動。一氧化氮(nitric oxide, NO)是一種脂溶性氣體分子且具有生物活性。【前人研究進展】NO可以介導(dǎo)植物多種生理生化和免疫防御反應(yīng)[14, 6]。NO在調(diào)節(jié)植物代謝和調(diào)控植物線粒體功能方面有著重要的作用。NO在線粒體中通過抑制細胞色素C的釋放量間接調(diào)節(jié)線粒體功能[17]。NO可以參與線粒體呼吸過程，調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)ROS的生成[18]?！颈狙芯壳腥朦c】外源NO處理可以增強植物線粒體的抗氧化性[19,20]。研究桃果實在冷藏期間NO對線粒體膜及線粒體抗氧化系統(tǒng)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以新泰紅桃為試材，用15 μmol/L NO、5 μmol/L c-PTIO (2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl- 3-oxide)浸泡處理桃果實，測定桃果實冷藏期間NO對其品質(zhì)影響，NO對冷藏期間桃果實線粒體完整性、線粒體活性氧及抗氧化酶活性的影響，為NO在桃果實貯藏保鮮應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

桃品種為新泰紅 (Prunspersica[L.] Batsch, cv. Xintaihong), 2017年7月18日采摘于山東省泰安市新泰市桃基地。選取無病蟲害、無機械損傷以及果個均勻的七成熟果實，0℃下過夜預(yù)冷后，樣品分為三組，每組100枚桃果實，分別用15 μmol/L NO、5 μmol/L c-PTIO 和對照 (去離子水)浸泡30 min。將處理后的桃果實放置于0℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，每一周取一次樣用于品質(zhì)相關(guān)指標測定，桃果實切成小塊后冷凍于-80℃保存用于線粒體提取。

1.2 方 法

1.2.1 硬度測定

采用艾德堡GY-4果實硬度計測定，探頭直徑為11 mm，測試結(jié)果取下壓峰值，每個處理取9個果實，每個桃果實取3個測量點測試，單位為N/cm2。

1.2.2 可溶性固形物含量

1.2.3 色差

利用色差計測定桃果實表面部分的顏色。以標準白度(L=97.06，a=0.04,b=2.01)來校準測定所使用的色差計。測定系統(tǒng)顯示(L*，a*，b*)

1.2.4 失重

用電子天平測定各組桃果實的鮮重，貯藏期間每隔一周用電子天平稱取每組桃果實的重量。失重率計算公式如下：

1.2.5 線粒體提取及純化

參照Jing的方法提取桃果實線粒體[21]。利用蔗糖密度梯度離心法純化線粒體，并用3 mL Tris-HCl緩沖液(pH 8.5 100 mmol/L)重懸浮。

1.2.6 線粒體耗氧量

線粒體耗氧量的測定參照潘儼的方法[22]，線粒體耗氧量表示為nmol min/ mg/protein。

1.2.7 線粒體呼吸控制率(RCR)

參照倪海霞[23]的方法用Hansatech液相氧電極測量線粒體呼吸控制率。RCR即加入ADP時(Ⅲ態(tài))的呼吸速率與ADP耗盡后(Ⅳ態(tài))的呼吸速率比值。

1.2.8 線粒體膜電勢

參考Baracca[24]方法來測定線粒體膜電勢。線粒體的膜電勢表示為[(ΔF/Fi)s/ mg/protein]。

1.2.9 線粒體細胞色素C含量

線粒體細胞色素C含量測定參照Balaban等[25]方法，根據(jù)標準曲線計算每克線粒體蛋白對應(yīng)細胞色素C含量(μmol)。

1.2.10 線粒體活性氧(ROS)含量

線粒體中ROS含量的測定參考Jambunathan[26]方法。桃果實中ROS的含量表示為a.u.mg/protein。

1.2.11 線粒體過氧化氫酶(CAT)活性

線粒體中CAT的活性測定參考 Zhong[27]方法，檢測液中由于CAT催化引起的240 nm下的吸光度每降低0.001個單位被定義為一個CAT酶活性(U)。線粒體中CAT的單位酶活性表示U mg/protein/sec。

1.2.12 線粒體過氧化物酶(POD)含量

桃果實線粒體內(nèi)POD含量測定參考Rahnama[28]方法。POD的單位酶活性定義由POD的催化作用引起的580 nm下每秒內(nèi)增加0.001個單位的吸光度定義為一個酶活性單位(U)。線粒體POD的活性表示為U mg/protein/sec。

1.2.13 線粒體超氧化物歧化酶(SOD)含量

桃果實線粒體SOD含量測定采用NBT光還原法[29]。線粒體SOD的活性以SOD抑制NBT的光還原率50%為酶活單位(U)。線粒體SOD的活性表示為 U mg/protein。

2 結(jié)果與分析

2.1 NO對冷藏桃果實品質(zhì)影響

研究表明，桃果實在冷藏過程中硬度呈下降趨勢，0 d時桃果實硬度為53 N/cm2，第5周時分別為32.2 (對照)、30.1 (c-PTIO)、38.8 N/cm2(NO)。貯藏期間，NO處理桃果實硬度均高于對照和c-PTIO處理，第3周，NO處理桃果實硬度是對照的1.23倍，是c-PTIO處理的1.33倍(圖1A)。0 d桃果實色差L*值為76.4，在桃果實冷藏貯藏期間一直下降，且在第5周達到最低值，NO處理桃果實色差L*值是對照處理的1.07倍，是c-PTIO處理的1.13倍(圖1B)。桃果實冷藏貯藏期間可溶性固形物含量處于下降趨勢，失重率處于上升趨勢，0 d時桃果實的可溶性固形物含量為14.55，失重率為0(圖1CD)。NO處理，可溶性固形物含量均高于對照和c-PTIO處理，貯藏期間，NO處理桃果實失重率低于對照和c-PTIO處理。第4周，NO處理，SSC是對照的1.09倍，c-PTIO的1.14倍。圖1

注：每組數(shù)據(jù)平均值±SE(n = 3)

圖1 桃果實在低溫貯藏期間不同NO溶液下硬度(A)、色差L值(B)可溶性固形物含量(C)和失重率(D)變化
Fig.1 Effects of NO solution on firmness (A), color difference L*value (B) soluble solid content (C) and weight loss rate (D) during low temperature storage of peach fruit

2.2 NO對冷藏桃果實線粒體影響

研究表明，桃果實線粒體呼吸耗氧量在0 d時是41.0 nmol min/mg/protein，冷藏桃果實線粒體呼吸在第3周達到峰值，之后開始下降，且在貯藏期間c-PTIO和對照處理桃果實耗氧量均高于NO處理。第5周，NO處理桃果實線粒體耗氧量是對照處理的71.9%，是c-PTIO處理的40.0%(圖2A)。線粒體RCR在第0 d時為2.9，低溫冷藏過程中線粒體RCR在第2周出現(xiàn)峰值后逐漸下降，且在整個貯藏期間NO處理桃果實線粒體RCR均高于對照和c-PTIO處理，第2周，NO處理桃果實線粒體RCR是對照的1.30倍；第4周，NO處理桃果實線粒體RCR是c-PTIO處理的1.57倍(圖2B)，NO處理可以維持線粒體完整性，減少線粒體耗氧量，延長桃果實貯藏期。冷藏期間，線粒體膜電勢隨著貯藏時間的增加而降低，0 d時線粒體膜電勢為20.4 s/g/protein，貯藏期間，NO處理桃果實線粒體膜電勢始終高于對照和c-PTIO處理。第2周，NO處理是對照的1.68倍，c-PTIO的2.39倍，在冷藏期間，NO處理可以有效的維持線粒體內(nèi)外離子和線粒體膜電勢平衡(圖2C)。桃果實在冷藏期間，線粒體細胞色素C含量隨著貯藏時間的增加而減少，0 d時，線粒體細胞色素C含量為24.8 μmol g/protein， NO處理低于對照和c-PTIO處理， 3周時，NO處理是對照的54.7%，是c-PTIO的50.1%(圖2D)。圖2

注：每組數(shù)據(jù)平均值±SE(n = 3)

圖2 桃果實在低溫貯藏期間不同NO濃度下線粒體耗氧量(A)、線粒體呼吸控制率(B)、線粒體膜電勢(C)以及線粒體細胞色素C含量(D)變化
Fig.2 Effects of NO on mitochondrial oxygen consumption (A), mitochondrial respiratory control rate (B), mitochondrial membrane potential (C) and mitochondrial cytochrome C content (D) during low temperature storage

2.3 NO對冷藏桃果實線粒體ROS含量的影響

研究表明，低溫貯藏過程中，線粒體ROS含量在第3周出現(xiàn)峰值后開始下降，c-PTIO處理明顯高于對照和NO處理。0 d時線粒體ROS含量為119.5 a.u mg/protein，第1周，NO處理是對照的50.4%，是c-PTIO處理的43.2%。清除NO后，線粒體完整性遭到破壞，線粒體ROS含量及膜脂過氧化損傷程度增加。圖3

注：每組數(shù)據(jù)平均值±SE(n = 3)

圖3 桃果實在低溫貯藏期間不同NO濃度下線粒體活性氧含量變化
Fig.3 Effects of NO on mitochondrial reactive oxygen species in peach fruit during low temperature storage

2.4 NO對冷藏桃果實線粒體抗氧化酶活性的影響

研究表明，低溫貯藏過程中，NO處理線粒體CAT活性均高于對照和c-PTIO處理，0 d時線粒體CAT活性為16.6 U min/mg/protein， 第2周，NO處理是對照的1.59倍，是c-PTIO的3.42倍(圖4A)。貯藏期間，線粒體POD呈下降趨勢，NO處理線粒體POD活性最高。0 d時，線粒體POD活性為128.2 U min/mg/protein，第3周，NO處理是對照的1.41倍。第4周，NO處理POD活性是c-PTIO處理的1.91倍(圖4B)。桃果實SOD活性受多種因素影響。NO處理桃果實線粒體SOD活性在整個貯藏期間活性最高，第1周，NO處理是對照的1.78倍。第4周，NO處理是c-PTIO處理的1.81倍，NO處理桃果實線粒體抗氧化酶活性均高于對照和c-PTIO處理。圖4

注：每組數(shù)據(jù)平均值±SE(n = 3)

圖4 桃果實在低溫貯藏期間不同NO濃度下線粒體抗氧化酶活性、過氧化氫酶(A)、過氧化物酶(B)、超氧化物歧化酶(C)變化
Fig.4 Effects of NO on mitochondrial antioxidant enzyme activity during peach storage during low temperature storage. CAT (A), POD (B), SOD (C)

3 討 論

硬度、SSC、水分含量及褐變是衡量果實商品價值的重要指標。常溫下，采后果蔬隨著貯藏時間的增加會出現(xiàn)硬度下降，失水、可溶性固形物含量及色差L*值下降等生理癥狀[30]。通過低溫冷藏可以減弱果蔬的呼吸強度從而達到保鮮的效果[31]。桃果實在冷藏過程中，硬度有短暫的增大趨勢，可能是桃果實在貯藏過程中隨著呼吸作用，酶活變化以及果膠變化等原因，大量失水，出現(xiàn)果皮皺縮的現(xiàn)象[32]。NO處理可以顯著維持桃果實的硬度，這與NO在桃果實貯藏期間抑制了纖維素和半纖維素的分解，減少果膠酸和可溶性果膠的含量有關(guān)[33,34]。

余克威等[35]發(fā)現(xiàn)NO不僅可以促進線粒體內(nèi)物質(zhì)的合成而且在調(diào)節(jié)線粒體介導(dǎo)細胞凋亡上有著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，低溫貯藏過程中，經(jīng)NO處理的桃果實可以保持線粒體的完整性，維持線粒體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，這與呂小華[36]的研究相似。ROS被認為是有害的分子，越來越受到廣泛關(guān)注，線粒體是細胞內(nèi)ROS的主要來源場所[37]。在正常的情況下，生物體內(nèi)的ROS是處于一種平衡的狀態(tài)，可以增強生物免疫功能，但是，采摘后，離開母體的營養(yǎng)供應(yīng)，桃果實的生理功能遭到破壞，ROS大量增加，破壞線粒體膜的完整性，釋放細胞色素C，從而引發(fā)線粒體膜電位變化，導(dǎo)致細胞凋亡[38]。已有研究表明，線粒體內(nèi)抗氧化酶可以有效地清除線粒體內(nèi)ROS含[39,40]量(研究發(fā)現(xiàn)在低溫冷藏過程，NO處理可以維持桃果實內(nèi)線粒體抗氧化酶活性，減少ROS的積累，在維持膜電勢的同時降低了細胞色素C含量，達到保鮮的效果)。在冷藏過程中，NO處理可以減緩線粒體的氧化損傷程度。

低溫冷藏期間，15 μmol/L NO處理可以維持桃果實品質(zhì)，保持線粒體完整性，延緩線粒體ROS含量增加，并提高線粒體抗氧化酶活性，從而維持線粒體抗氧化系統(tǒng)的穩(wěn)定，減弱線粒體的氧化損傷。

4 結(jié) 論

4.1 冷藏貯藏期間NO可以維持桃果實硬度，延緩色差L*值的下降，提高SSC并降低桃果實的失重率。NO處理可以維持桃果實的品質(zhì)，起到貯藏保鮮的效果。NO可以維持線粒體膜完整性，降低細胞色素C的含量，從而維持細胞的活性。NO處理桃果實線粒體抗氧化酶有效的清除了線粒體內(nèi)過多的ROS，維持了線粒體內(nèi)的動態(tài)平衡。

4.2 在第5周時，桃果實品質(zhì)指標分別為0 d的73.2%(硬度)，87.2%(色差L值)，1.02倍(SSC)，NO處理延長桃果實貯藏時間；NO可以維持桃果實低溫貯藏過程線粒體膜電勢，在第5周時為0 d的50%，NO處理維持線粒體完整性及線粒體生理功能。NO通過維持線粒體內(nèi)抗氧化酶活性降低線粒體內(nèi)ROS含量，第5周時NO處理桃果實ROS含量為對照處理的89.8%，c-PTIO處理的82.9%，在桃果實低溫冷藏過程中，NO處理通過降低線粒體中ROS含量來提高線粒體抗氧化系統(tǒng)的穩(wěn)定性。