馬杜拉放線菌（Actinomadura sp.）FXJ1.344發(fā)酵產(chǎn)物的分離鑒定與活性分析

余 成，劉 寧，張志敏，黃 英，岳昌武*

（1.遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 遵義醫(yī)學(xué)院貴州省微生物資源及藥物開(kāi)發(fā)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563003；2.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 微生物資源前期開(kāi)發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100020；3.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，貴州 遵義 563003）

迄今為止，已知得到實(shí)際應(yīng)用的微生物活性物質(zhì)中超過(guò)一半成來(lái)自放線菌[1]，而目前從放線菌中發(fā)現(xiàn)的次級(jí)代謝產(chǎn)物數(shù)量不足其實(shí)際存在的10%[2]。因此，對(duì)放線菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行挖掘是發(fā)現(xiàn)創(chuàng)新藥物的重要途徑。由于生境（如海拔、緯度、濕度等）均對(duì)放線菌的生長(zhǎng)代謝甚至進(jìn)化都有巨大的影響[11]，所以在特殊生境下分離得到的特殊放線菌，從中獲得新的生物活性物質(zhì)的可能性也更高[3]。

馬杜拉放線菌（Actinomadura sp.）是一種稀有放線菌，可產(chǎn)生四大家族的有高抗腫瘤活性的抗生素，分別為veractamycins、FR-900405同類(lèi)物、esperamicins及barminomycins[4]。甄永蘇等[5]對(duì)一株馬杜拉放線菌進(jìn)行了研究并發(fā)現(xiàn)了其發(fā)酵產(chǎn)物洋紅霉素（carminomycin），其作為抗腫癌化療藥物曾應(yīng)用于臨床多年[6]。而與之結(jié)構(gòu)近似的蒽環(huán)類(lèi)抗生素柔紅霉素（daunorubicin）仍是臨床一線化療藥物，其在市場(chǎng)上供不應(yīng)求，國(guó)內(nèi)外一直在對(duì)采用生物發(fā)酵法制備柔紅霉素的技術(shù)進(jìn)行研究[7-8]。

江西紅壤為一種富含鐵、鋁的酸性土壤，由于其特殊的生境條件，其中生長(zhǎng)著許多特殊的放線菌[9]。本課題組從江西武山的紅壤中分離得到了一株馬杜拉放線菌（Actinomadura sp.）FXJ1.344。采用改良培養(yǎng)基，對(duì)這株馬杜拉放線菌發(fā)酵培養(yǎng)后，將代謝產(chǎn)物分離純化，并采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）制備化合物純品，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）分析和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）儀檢測(cè)，并將數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)比對(duì)，鑒定菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。對(duì)純化物的抗菌活性和最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）檢測(cè)，以期為抗生素開(kāi)發(fā)提供潛在的先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 測(cè)試菌株

馬杜拉放線菌（Actinomadura sp.）FXJ1.344：分離自江西武山取樣點(diǎn)10～20 cm深的酸性紅壤；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）：濰坊醫(yī)學(xué)院；多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）：北京307醫(yī)院[16]；藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、綠色木霉菌（Trichoderma viride）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：土豆淀粉10 g，葡萄糖10 g，甘油10 g，玉米漿2.5 g，蛋白胨5 g，酵母提取物2 g，人工海鹽1 g，碳酸鈣3 g，加雙蒸水定容至1 L。

菌株活化培養(yǎng)基采用葡萄糖酵母提取物麥芽提取物（glucose yeast extract malt extract，GYM）固體培養(yǎng)基：葡萄糖4 g，碳酸鈣2 g，麥芽抽提物10 g，酵母抽提物4 g，瓊脂粉18 g，加雙蒸水定容至1 L。

細(xì)菌采用LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂、LB肉湯培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；真菌采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，雙蒸水1 L。

1.1.3 化學(xué)試劑

乙醇、甲醇、氯仿、甲醇、乙腈（均為分析純）：北京化工廠；甲醇、乙腈、甲酸等（均為色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

硅膠60薄層層析鋁箔板：德國(guó)默克公司；柱層層析硅膠（200～300目）：青島海洋化工廠；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱：美國(guó)GEHealthcare公司；MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋：日本三洋株式會(huì)社；SPX-250B-Z培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；Himac CF15RX高速離心機(jī)：日本日立公司；ZQZY-CF振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；LC-20A高效液相色譜儀：日本島津有限公司；G2-QTof超高效液相色譜四級(jí)桿飛行質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)沃特世有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株發(fā)酵及產(chǎn)物粗提

種子培養(yǎng)：采用劃線法將菌種活化接種于90 mm規(guī)格GYM固體培養(yǎng)基平皿中，28℃恒溫培養(yǎng)4～5 d使得氣生菌絲和孢子絲發(fā)育完善[15]。將活化菌株接種至發(fā)酵用改良VER培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)基平皿，28℃靜置培養(yǎng)5 d，以獲得馬杜拉放線菌（Actinomadura sp.）FXJ1.344的種子菌。將培養(yǎng)皿的帶菌瓊脂塊切割為1 cm×1 cm厚度為0.5 cm大小的種子塊。

發(fā)酵培養(yǎng)：使用30個(gè)500 mL錐形瓶（每瓶含有100 mL改良VER液體培養(yǎng)基，共計(jì)3 L）進(jìn)行液體發(fā)酵，每瓶接種約0.5 cm3GYM固體含菌瓊脂塊，28℃條件下160 r/min振蕩培養(yǎng)8 d后取出。

發(fā)酵產(chǎn)物粗提：將培養(yǎng)完成后的發(fā)酵液在8 000 r/min條件下離心10min分離上清液和菌絲體。將菌絲體收集后，使用等體積無(wú)水乙醇振蕩抽提3次，每次抽提約8 h；合并乙醇抽提液后減壓濃縮并用少量甲醇溶解，減壓濃縮得菌絲體粗提物（約12 g）。

1.3.2 粗提物的HPLC分析檢測(cè)

取菌絲體粗提物50μg，溶解于400μL的甲醇中，離心取上清，取20μL進(jìn)行HPLC分析其組成成分，從中選擇響應(yīng)值高且分離度較好的峰，作為目標(biāo)化合物。其色譜條件為：Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm），柱溫28℃；流速1.0 mL/min；甲醇與水梯度洗脫（起始為20%甲醇+80%水；0～15 min甲醇體積分?jǐn)?shù)由20%梯度遞增至100%；15～20 min保持100%甲醇；20 min至26.5 min維持20%甲醇+80%水不變）。

1.3.3 粗提物的硅膠柱層析

用硅膠柱層析法對(duì)粗提物進(jìn)行分離[13]。采用干法上樣，流動(dòng)相條件使用氯仿甲醇梯度洗脫，以氯仿∶甲醇（95∶5，V/V）比例起始，每100 mL流動(dòng)相增加5%的甲醇比例，遞增至60∶40（V/V）截止。接柱時(shí)以每10 mL為一個(gè)流分，共收集90個(gè)流分。

用薄層層析法（thin layer chromatography，TLC）將流分分段。在薄層層析硅膠板上對(duì)90個(gè)流分的偶數(shù)號(hào)樣品點(diǎn)樣分析，在紫外燈下觀察其熒光[18]。其熒光相同的樣品點(diǎn)判定為含有相同組分，將相同組分的樣品合并。HPLC對(duì)合并后的樣品段進(jìn)行檢測(cè)，觀察各分段的組分情況，選擇目標(biāo)產(chǎn)物較多、樣品量較多、組分相對(duì)簡(jiǎn)單且包含所有目標(biāo)峰的分段，作為后續(xù)純化的樣品。

1.3.4 粗提物的凝膠柱層析

用LH-20葡聚糖凝膠柱對(duì)菌絲體粗提物硅膠層析柱各個(gè)濃縮后的合并流分進(jìn)行分子篩：流分濃縮并濕法上樣后采用甲醇∶氯仿1∶1（V/V）混合溶劑作為流動(dòng)相，等度洗脫，按照每管3 mL收集洗脫液，用1.3.3中的方法，用TLC檢測(cè)合并分段，用HPLC檢測(cè)選擇下一步的樣品段。

1.3.5 目的產(chǎn)物的HPLC制備與鑒定

將LH-20葡聚糖凝膠柱分離后得到的樣品段進(jìn)行HPLC制備，其色譜條件為：Waters XBridge C18色譜柱（5μm，4.6 mm×150 mm），柱溫維持28 ℃；甲醇∶水88∶12（V/V）等度洗脫。采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和核磁對(duì)得到的目標(biāo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.3.6 化合物的抗菌活性測(cè)試

配制質(zhì)量濃度為50μg/mL目標(biāo)化合物的甲醇溶液，采用濾紙片法對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行抗菌活性測(cè)試[14]。測(cè)試菌包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、綠色木霉菌、尖孢鐮刀菌。具體測(cè)試方法如下：細(xì)菌采用LB固體平皿37℃過(guò)夜培養(yǎng)，以質(zhì)量濃度為50μg/mL目標(biāo)化合物的甲醇溶液為實(shí)驗(yàn)組，以100 mg/mL的廣譜抗菌藥物安普霉素的甲醇溶液為陽(yáng)性對(duì)照，以純甲醇為陰性對(duì)照，在每片濾紙片（直徑為6 mm）上滴加10μL樣品，貼在涂布有1 mL約（106～107）個(gè)/mL濃度測(cè)試菌菌懸液的固體培養(yǎng)基平皿上培養(yǎng)，細(xì)菌采用LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)8～12 h；真菌采用PDA培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)24～48 h，后觀察抑菌圈直徑[11]。

采用對(duì)倍稀釋法[12]測(cè)試目標(biāo)化合物的最小抑菌濃度（MIC）。將目標(biāo)化合物與安普霉素分別配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液。將藤黃微球菌于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至透光率為40%后稀釋1 000倍待用。用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)渲瞥蓾舛葹?05個(gè)/mL的菌懸液。在96孔板中加入100μL LB培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，加入100μL上述105個(gè)/mL不加藥測(cè)試菌液作為陰性對(duì)照，并采用安普霉素作為陽(yáng)性對(duì)照藥?；衔镉肔B液體培養(yǎng)基對(duì)倍稀釋成各所需濃度，分別與90μL菌懸液混勻加入96孔板，體系終體積為100μL。生長(zhǎng)6～8 h后無(wú)菌生長(zhǎng)的孔板內(nèi)所含化合物最低濃度，即為該目標(biāo)化合物對(duì)耐藥藤黃微球菌的MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌（Actinomadura sp.）FXJ1.344的菌絲體粗提物的制備與檢測(cè)

將放線菌（Actinomadura sp.）FXJ1.344的菌絲體用無(wú)水乙醇提取，得到粗提物用HPLC檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，菌絲體粗提物中成分相對(duì)簡(jiǎn)單，選擇保留時(shí)間14.5min出為目標(biāo)峰A，保留時(shí)間18.5 min處為目標(biāo)峰B，保留時(shí)間19.3 min處為目標(biāo)峰C。

圖1 菌株FXJ1.344菌絲體粗提物的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mycelium crude extract of strain FXJ1.344

2.2 菌絲體粗提物分離與分段

菌絲體粗品用硅膠柱層析粗分后得到90個(gè)流分，偶數(shù)號(hào)樣品點(diǎn)板用TLC分析，部分結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，26號(hào)至52號(hào)的薄層層析在兩種波長(zhǎng)紫外線照射下的熒光，32號(hào)樣與34號(hào)樣品組分不同，44號(hào)與46號(hào)樣品不同。故將32號(hào)后至46號(hào)前（均不含）的合并為33～45段。

圖2 菌絲體粗提物部分分段在365 nm(A)和254 nm(B)的TLC熒光圖Fig.2 TLC fluorogram of part of mycelium crude extract in 365 nm(A)and 254 nm(B)

圖3 硅膠柱層析后1～13段(A)、14～32段(B)、33～45段(C)及46～90(D)段的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of 1-13(A),14-32(B),33-45(C)and 46-90(D)segments after silica gel column chromatography

采用類(lèi)似分析方法，將90個(gè)流分分為四大段：1～13、14～32、33～45、46～90段。將分段合并后用HPLC檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，第一段組分極少，第二段缺少目標(biāo)峰B，第三段中目標(biāo)峰A處雜峰很多不利于后期分離，第四段組分得到了較好的分離，目標(biāo)峰齊全且樣品量大。故選擇第四段作為后續(xù)純化的樣品。

2.3 菌絲體粗提物高效液相色譜法制備

將46～90段的濃縮液為樣品，用葡聚糖凝膠柱層析法得到47個(gè)流分，經(jīng)TLC和HPLC檢測(cè)分段，選取16～28段樣品為HPLC的制備樣品。將樣品段濃縮處理，用甲醇水等度洗脫制備各化合物，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，制備得到保留時(shí)間（retention time，TR）分別為T(mén)RA=2.00 min、TRB=6.20 min、TRC=8.10 min化合物A（4.0 mg）、B（3.0 mg）和C（2.0 mg），經(jīng)過(guò)核磁檢測(cè)發(fā)現(xiàn)化合物A為混合物，化合物B和C是純化物。

2.4 結(jié)構(gòu)鑒定

采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)化合物B的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定：深綠色針狀晶體，m/z321.0764[M+H]+，分子式：C19H12O5，計(jì)算不飽和度為14；UV λmax：224 nm、316 nm、454 nm（in MeOH）：1H-NMR（CDCl3，500 MHz）：2.38（3H，s，3-Me），6.88（1H，d，J=1.0 Hz，2-H），7.02（1H，s，4-H），7.27（1H，d，J=8.5 Hz，9-H），7.59（1H，s，5-H），7.65（1H，dd，J=8.0，7.0 Hz，10-H），7.78（1H，d，J=7.5，Hz，11-H），10.24（1H，s，1-OH），11.70（1H，s，8-OH），12.05（1H，s，6-OH）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）：21.4（C3-Me），114.7（C-7a），118.3（C3），118.5（C2），119.7（C-4），119.7（C-6a），121.6（C-11），124.0（C-5），125.1（C-9），132.8（C-12a），135.0（C-11a），137.7（C-10），141.5（C-12b），142.8（C-4a），154.3（C-1），156.6（C-6），161.9（C-8），189.2（C-12），193.2（C-7）；根據(jù)天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，以上數(shù)據(jù)與化合物6-hydroxytetrangulol[10]保持一致，推定化合物B為6-hydroxytetrangulol。

圖4 凝膠柱層析后菌絲體粗提物樣品HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of mycelium crude extract sample after gel column chromatography

采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法化合物C的結(jié)構(gòu)鑒定：紅褐色針狀晶體，m/z305.0814[M+H]+，分子式：C19H12O4，計(jì)算不飽和度為14；UVλmax：223 nm、314 nm、428 nm（in MeOH）：1H-NMR（CDCl3，500 MHz）：2.51（3H，s，3-Me），7.17（1H，s，2-H），7.28（1H，s，4-H），7.34（1H，d，J=8.5 Hz，9-H），7.70（1H，dd，J=8.5，7.5 Hz，10-H），7.87（1H，d，J=7.5 Hz，11-H），8.16（1H，d，J=9.0，6-H），8.34（1H，d，J=8.5，5-H），11.27（1H，s，1-OH），12.26（1H，s，8-OH）；13C-NMR（CDCl3，125MHz）：21.3（C3-Me），114.7（C-7a），120.0（C3），120.2（C2），121.3（C-4），121.3（C-6），121.29C-6a），121.9（C-11），124.8（C-9），132.4（C-12a0，134.89C-11a），136.9（C-5），137.79C-10），139.1（C-4a），142.0（C-12b），155.3（C-1），161.7（C-8），187.9（C-7），189.7（C-12）；根據(jù)天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，以上數(shù)據(jù)與化合物tetrangulol[10]保持一致，推定化合物C為tetrangulol?；衔顱、C的結(jié)構(gòu)式如下：

6-hydroxytetrangulol（B）：R=OH，tetrangulol（C）：R=H

2.5 純化物B、C的抗菌活性測(cè)定

采用濾紙片法對(duì)化合物6-hydroxytetrangulol和tetrangulol進(jìn)行活性測(cè)試，以甲醇為陰性對(duì)照，抗菌活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 化合物B(6-hydroxytetrangulol)和化合物C(tetrangulol)對(duì)耐藥藤黃的濾紙片法抑菌活性測(cè)試Fig.5 Antibacterial activity tests of compound B(6-hydroxytetrangulol)and compound C(tetrangulol)by filter paper method

由圖5可知，純化物B、C均對(duì)藤黃微球菌（Micrococcus luteus）有較強(qiáng)的抑制活性，抑菌圈直徑分別為16 mm和14 mm，而對(duì)其他測(cè)試菌均無(wú)明顯活性。

用對(duì)倍稀釋法檢測(cè)兩個(gè)化合物的對(duì)這株耐藥藤黃微球菌的最低抑菌濃度（MIC），通過(guò)肉眼觀察和酶標(biāo)儀檢測(cè)，得到陽(yáng)性對(duì)照安普霉素對(duì)這株菌的MIC為7.81μg/mL，純化物B（6-hydroxytetrangulol）對(duì)這株菌的MIC為3.90 μg/mL，純化物C（tetrangulol）對(duì)這株菌的MIC為15.6 μg/mL。

3 結(jié)論

Angucyclinone類(lèi)抗生素一直受到廣泛而持久的關(guān)注，此類(lèi)化合物也在不斷地被挖掘發(fā)現(xiàn)[17]。盡管化合物6-hydroxytetrangulol和tetrangulol并非首次發(fā)現(xiàn)，但近年來(lái)少有國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)對(duì)其抗菌活性進(jìn)行研究，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其較好的抗藤黃微球菌活性為首次報(bào)導(dǎo)。本研究通過(guò)分離純化方法，對(duì)江西酸性紅壤來(lái)源的馬杜拉放線菌（Actinomadura sp.）FXJ1.344的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了純化和鑒定，在其次級(jí)代謝產(chǎn)物中得到了2種angucyclinone類(lèi)純化物6-hydroxytetrangulol和tetrangulol。用濾紙片法和對(duì)倍稀釋法對(duì)其抗菌活性做了研究，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)化合物均有較好的抗藤黃微球菌活性，其MIC值顯示與安普霉素的抗菌活性相當(dāng)甚至更佳，有潛在的成藥價(jià)值。本研究為未來(lái)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)這兩種化合物進(jìn)行了初步探尋，為尋找開(kāi)發(fā)新抗生素提供了先導(dǎo)化合物。

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