微生物葡萄糖氧化酶的研究進展

李 蓉，張慶芳，遲乃玉*

（1.大連大學 生命科學與技術(shù)學院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）EC 1.1.3.4是一類含有黃素腺嘌呤二核苷酸（flavine adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）的二聚體蛋白酶，能夠以分子氧為電子受體，特異性催化β-D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，并產(chǎn)生H2O2，具有廣泛的應用價值[1]。GOD作為制造葡萄糖檢測傳感器的重要酶制劑[2]，在醫(yī)療領(lǐng)域和發(fā)酵工業(yè)應用較多。GOD作為食品添加劑，能夠抑菌、延長商品貨架期、防止食物褐變以及用于生產(chǎn)低酒精度紅酒[3]。此外，GOD還可用于生產(chǎn)燃料電池和飼料添加劑，在能源領(lǐng)域和養(yǎng)殖業(yè)中有潛在應用價值[4-5]。GOD廣泛存在于微生物及昆蟲體內(nèi)，前者因繁殖快、操作簡單、成本低等優(yōu)點，已成為GOD資源開發(fā)的主要來源[6-7]。本文介紹了GOD的微生物來源、分離純化、發(fā)酵、克隆表達、應用方面的研究進展，并對研究前景進行了展望，旨在深入了解GOD，為其理論研究及生產(chǎn)應用提供參考。

1 GOD的微生物來源[8-10]

自黑曲霉（Aspergillusniger）中的GOD首次被發(fā)現(xiàn)以來，研究者在多種微生物中檢測到GOD，其中曲霉屬（Aspergillus sp.）、青霉屬（Penicillium sp.）為GOD的主要來源。近年，在一些酵母和細菌中也發(fā)現(xiàn)GOD。隨著高通量篩選技術(shù)的應用，相信會有更多產(chǎn)GOD菌株被發(fā)現(xiàn)。

1.1 真菌來源

MULLERD[11]在1928年首次于黑曲霉（A.niger）無細胞提取物中發(fā)現(xiàn)并命名了GOD；1936年又首次于灰綠青霉（Penicillium glaucum）中發(fā)現(xiàn)GOD[12]。之后，大量產(chǎn)GOD的曲霉和青霉屬真菌被發(fā)現(xiàn)。真菌因產(chǎn)酶量高，成為目前GOD研究的主要對象。2013年，F(xiàn)ARID M A等[13]首次從黑曲霉（A.niger）NRC中分離到GOD，將GOD生產(chǎn)推向海洋領(lǐng)域。2015年，KRIAA M等[14]從塔賓曲霉（Aspergillustubingensis）CTM 507中分離到GOD，該GOD在pH 3～9的范圍內(nèi)酶活穩(wěn)定，具有抗真菌活性，首次表明該GOD能夠用于農(nóng)業(yè)病原菌防治。2017年，YUIVARY等[15]檢測了多株南極酵母，從中篩選到5株產(chǎn)GOD菌株，其中，G.gastricus分泌的GOD酶活最高，催化效率達到1.4×107mol/（L·s）；最適反應pH 5.6；最適反應溫度64℃，相比黑曲霉（A.niger）、尼崎青霉（Penicillium amagasakiense）等來源的GOD在25～40℃條件下有更高的酶活，并且在4℃仍保留約10%的酶活，拓寬了GOD的低溫真菌來源。

國內(nèi)對GOD的系統(tǒng)研究始于20世紀70年代。葡萄糖氧化酶協(xié)作組[16]從367株青霉和曲霉中篩選到GOD高產(chǎn)菌點青霉（Penicillium notatum）AS 3.3871，以蔗糖為碳源，NaNO3為氮源，振蕩培養(yǎng)后經(jīng)靜置，酶活達到15～18 U/mL。發(fā)酵液經(jīng)弱酸性陽離子交換柱層析后濃縮，得到GOD酶制劑，用于處理蛋清，能夠除去其中的葡萄糖，有效防止干蛋白片的褐變。2013年，朱運平等[17]從全國120余份土樣中篩選到高產(chǎn)GOD的黑曲霉（A.niger）1504，該菌株同時合成胞外GOD（55.08 U/mL）和胞內(nèi)GOD（80.58 U/mL），經(jīng)紫外-亞硝酸鈉復合誘變，獲得遺傳穩(wěn)定性高的突變菌UNⅡ021，其胞外GOD酶活達到186.32 U/mL。江南大學酶工程實驗室長期從事GOD研究，從最初的菌株篩選，到黑曲霉（A.niger）Z-25的god基因異源表達于巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）提高產(chǎn)量，再到對重組菌進行改造，于2015年使GOD酶活達到1 634.7 U/mL，為有史以來報道的最高值[18]。

1.2 細菌來源

目前關(guān)于產(chǎn)GOD細菌的報道較少。2013年，雷湘南等[10]從2 835株細菌中初篩出490株產(chǎn)酸菌，后經(jīng)發(fā)酵復篩出7株產(chǎn)GOD細菌。經(jīng)鑒定，6株為桿菌，1株為球菌（見表1）[12-14]。其中4株分泌胞外GOD，有2株為蒼白桿菌，蒼白桿菌B2059酶活最高，為0.1779μmol/mL。2014年，石漱鈺等[19]首次報道了產(chǎn)GOD的海洋假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa），該菌株所產(chǎn)GOD酶活達5.51 U/mL，最適催化溫度20℃，為低溫酶，最適反應pH 7.0，在低溫保鮮、食品低溫加工中有潛在應用價值。

表1 葡萄糖氧化酶微生物來源Table 1 Microbial source of glucose oxidase

2 GOD的克隆表達及發(fā)酵生產(chǎn)

2.1 GOD的克隆表達

通常野生菌株GOD產(chǎn)量較低，發(fā)酵時伴隨其他酶的分泌，增加了GOD的分離純化難度，對GOD產(chǎn)業(yè)化造成了嚴重影響。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，基因克隆和表達成為提高GOD產(chǎn)量的重要措施。目前，多種來源的GOD被克隆，并在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、畢赤酵母（P.pastoris）、多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha）以及青霉屬（Penicillium sp.）等宿主中成功表達[20-21]。

1995年，GEISEN R[22]將黑曲霉（A.niger）的god基因插入pSK+3.Sma載體，導入納地青霉（P.nalgiovense）ATCC 66742后獲得成功表達，GOD酶活得到提高。之后有研究發(fā)現(xiàn)[3]，霉菌在發(fā)酵過程中，菌絲會影響攪拌效果，導致菌體與發(fā)酵液接觸不良，造成GOD產(chǎn)量低。繼而酵母菌憑借蛋白產(chǎn)量高、產(chǎn)物與菌體易分離等優(yōu)點成為深層發(fā)酵的最佳宿主[23]。2003年，MALHERBED F等[3]將黑曲霉（A.niger）的god基因成功表達于釀酒酵母（S.cerevisiae），并研究了GOD在低酒精度紅酒生產(chǎn)中的應用。過去幾十年，釀酒酵母（S.cerevisiae）被認為是GOD異源表達的有效體系，但最近研究發(fā)現(xiàn)，以S.cerevisiae為表達系統(tǒng)，會引起重組GOD的高糖基化表達[12，24]。畢赤酵母（P.pastoris）系統(tǒng)可有效表達蛋白，而不會導致GOD的過度糖基化，已成為應用最廣泛的表達系統(tǒng)之一[25-26]。2014年，GAOZW等[1]首先克隆了點青霉（P.notatum）F4的god基因，根據(jù)畢赤酵母（P.pastoris）密碼子偏好優(yōu)化基因，然后插入pPIC9載體，并導入畢赤酵母（P.pastoris）GS115表達，發(fā)酵后，GOD酶活達到615U/mL，蛋白質(zhì)量濃度達2.5 g/L，超過發(fā)酵液上清中總蛋白濃度的80%。2017年，陳楠等[26]將黑曲霉（A.niger）PCTC的god基因插入具有AOX1強啟動子的pPICZαA表達載體，后導入畢赤酵母（P.pastoris）SMD1168，經(jīng)篩選、產(chǎn)酶條件優(yōu)化，最高酶活達到32 U/mL。

2.2 GOD的發(fā)酵優(yōu)化

GOD可由固態(tài)或深層發(fā)酵法生產(chǎn)，其發(fā)酵研究有近30年[27]的歷史。雖然大量菌株可合成GOD，但因低產(chǎn)量問題無法直接用于工業(yè)生產(chǎn)。發(fā)酵優(yōu)化是提高酶產(chǎn)量的重要方式，隨著專業(yè)軟件的發(fā)展，GOD發(fā)酵優(yōu)化從傳統(tǒng)的單因素優(yōu)化法逐漸發(fā)展到統(tǒng)計優(yōu)化法。2001年，KONA RP等[28]對黑曲霉（A.niger）進行GOD發(fā)酵優(yōu)化，以玉米漿為唯一營養(yǎng)物質(zhì)，使GOD酶活從（580±30）U/mL提高至（850±45）U/mL。2016年，郭云瑕等[29]對紫外誘變后的黑曲霉進行單因素發(fā)酵條件優(yōu)化，以5%接種量，在30℃、160 r/min條件下發(fā)酵72 h，酶活達到優(yōu)化前的9.56倍。2013年，F(xiàn)ARID M A等[10]對海洋黑曲霉（A.niger）NRC9進行GOD發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，首先利用單因素設(shè)計，篩選出對GOD發(fā)酵最為重要的4個因素：葡萄糖、CaCO3、（NH4）2HPO4和MgSO4，之后利用部分析因設(shè)計和響應面法，確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基。經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化，酶活從（109.81±1.38）U/mL提高至（170±0.88）U/mL。

大量研究結(jié)果表明[30]，在GOD發(fā)酵生產(chǎn)中，碳源是主要的誘導劑，最適碳源通常是葡萄糖、蔗糖或糖漿，在發(fā)酵過程中控制高碳氮比通常會得到更高的GOD產(chǎn)量。CaCO3也為發(fā)酵所必需，可誘導GOD合成，防止發(fā)酵過程中pH降低、提高GOD產(chǎn)量。此外，F(xiàn)e2+、Zn2+等金屬離子也可作為誘導劑誘導GOD的產(chǎn)生[31]。而GOD生產(chǎn)過程中，H2O2會抑制GOD的合成。

3 GOD的分離純化

為研究酶的結(jié)構(gòu)和功能以及推動商品化，20世紀40年代即開始對GOD的純化。GOD分子質(zhì)量為130～175 ku，其純化過程應用到了沉淀法、超濾、層析法[32]。1964年，PAZURJH等[33]通過硫酸銨鹽析、DEAE-纖維素層析純化到黑曲霉（A.niger）GOD，研究了該酶對不同底物的催化速率，對不同能力做了解釋。近年，超濾因不會對酶造成破壞，酶回收率高等優(yōu)點受到重視。繩狀青霉（P.funiculosum）46分泌兩種GOD，SEMASHKO T V等[34]開發(fā)了一種超濾膜分離法對兩種GOD進行純化。發(fā)酵液離心后經(jīng)0.2μm尼龍膜過濾，分別使用截留分子質(zhì)量為100 ku、50 ku和20 ku的超濾膜超濾，最終GOD濃度占起始濃度的90%，比活914～956 IU，純化效果理想。目前國內(nèi)生產(chǎn)的GOD存在嚴重的純度不高問題，使用的GOD主要依賴于進口，價格昂貴，GOD的純化仍是我國未來研究的重點。

4 GOD的應用

20世紀40年代國外開始出現(xiàn)GOD產(chǎn)品，到70年代對GOD的應用已十分普遍。我國緊跟市場需求，1960年，河南省輕化工業(yè)廳研究設(shè)計院將GOD應用于蛋品加工，1966年，中科院微生物研究所將篩選的GOD優(yōu)良菌株投入生產(chǎn)，用于干蛋白片加工、尿糖試紙生產(chǎn)及實驗室分析。1999年，GOD被我國農(nóng)業(yè)部列入允許使用的飼料添加劑，用于維持畜禽腸道菌群、抑制霉菌生長、降解毒素等[35]。進入21世紀后，隨著個體化醫(yī)療的加快，使得葡萄糖檢測傳感器成為研究熱點?，F(xiàn)今，傳感器生產(chǎn)已成為GOD應用研究的主要領(lǐng)域，國內(nèi)外研究數(shù)量顯示，我國在該方面取得豐碩成果。

4.1 在醫(yī)藥行業(yè)中的應用

糖尿病是世界第三大疾病，血糖的檢測是病情護理的重要部分。從1962年首次提出GOD電極概念至今，GOD傳感器已發(fā)展至第三代，成為檢測葡萄糖的主要工具[36]。GOD傳感器以GOD特異催化葡萄糖為基礎(chǔ)，通過檢測GOD上電子的變化來測定溶液中葡萄糖濃度，也可通過熒光檢測GOD分子中黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）的變化來作用。何順珍等[37]利用GOD與羅丹明6G建立了一種測定恒量葡萄糖的新型熒光猝滅法，用于血糖測定，操作簡便，結(jié)果可靠。近年，多種納米材料被用于固定GOD以改善傳感器功能。WUC等[38]研制出一種納米多孔金固定化的GOD電極，對葡萄糖有很高的敏感性，對膽固醇，三丁酸甘油酯、抗壞血酸等有很強的抗干擾能力，使用壽命長，用于人血清葡萄糖檢測，結(jié)果與全自動分析儀一致。另外，GOD催化產(chǎn)生的葡萄糖酸可用于生產(chǎn)葡萄糖酸鹽類保健品。

4.2 在食品行業(yè)中的應用

傳統(tǒng)食品加工中通常使用化學添加劑保持食品新鮮、延長貨架期，但其使用不當會對人體造成危害。GOD作為食品添加劑，能夠分解葡萄糖，防止食品氧化并有抑菌作用。1998年，VEMULAPALLIV等[39]將GOD加入面團，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的H2O2使面團更有彈性，黏性更大，開創(chuàng)了GOD作為食品添加劑的應用。VALENCIA PL等[40]在紅酒釀造中使用GOD/過氧化氫酶（catalase，CAT）酶系統(tǒng)，降低了葡萄糖的濃度，生產(chǎn)出低酒精度紅酒，抑制了腐敗菌的生長。食物中添加GOD，還可防止美拉德反應的發(fā)生，避免食物褐化和保持食品風味。此外，南美白對蝦經(jīng)GOD處理后于4℃貯藏120 h，色澤、氣味、咀嚼性、彈性等品質(zhì)指標都顯著優(yōu)于對照組[41]，表明GOD有一定的保鮮作用。

4.3 開發(fā)生物燃料

能源危機和環(huán)境污染問題日益嚴重，使得以酶為主體的燃料電池開發(fā)受到廣泛關(guān)注。GOD用于生物燃料生產(chǎn)已取得卓越成果。鄒瓊等[42]利用E-TEK Pt/C陰極和新型燃料電池陽極（GOD/CNTs-β-CD-Fc/GC）構(gòu)建了燃料電池，最大功率密度（33μW/cm，0.18 V），連續(xù)工作9 h，仍有92%開路電位，穩(wěn)定性好，為燃料電池設(shè)計提供了新思路。

4.4 在其他方面的應用

在其他方面，GOD也發(fā)揮著重要作用。作為飼料添加劑，具有除氧、產(chǎn)酸、排除毒素、抑菌和維持腸道微生態(tài)平衡等獨特作用[43]。我國在這方面研究較多，取得了豐碩成果。侯振平等[44]在斷奶仔豬飼料中添加180 U/kg GOD后，相比對照組，仔豬對干物質(zhì)和粗蛋白的消化率顯著提高，腹瀉率顯著降低，提高了仔豬生長性能。除此之外，GOD催化產(chǎn)生的H2O2可用于漂白織物。GOD具有很大的應用潛力，開發(fā)催化效率高、穩(wěn)定性強的GOD在實際的應用中至關(guān)重要。

5 展望

目前國內(nèi)外報道的GOD酶活普遍較低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。海洋資源的開發(fā)，為尋找高活性GOD提供了新途徑。研究人員也在不斷努力優(yōu)化發(fā)酵過程和純化步驟，提高GOD的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。此外，隨著生物和其他學科技術(shù)的發(fā)展，提高GOD的異源表達水平，對酶進行修飾改善活性，擴大GOD的應用領(lǐng)域，深入酶的應用機理研究也將是今后的發(fā)展方向。

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