響應(yīng)面輔助優(yōu)化黑枸杞中花青素提取及其穩(wěn)定性初步研究

楊　萍,黃佳蕊

黑枸杞屬于枸杞屬，味道甘甜，營養(yǎng)物質(zhì)豐富[1]。黑枸杞中的花青素具有多種藥理活性，并且具有珍貴的藥用價值，被稱為“軟黃金”[2]。花青素(屬于酚類)是一種水溶性色素[3]，花青素具有明顯的抗衰老作用[4]?；ㄇ嗨啬軌虮Ｗo人的眼睛[5]，改善關(guān)節(jié)的柔韌性[6]，增加血管壁的彈性，改善血液循環(huán)系統(tǒng)[7]。本試驗采用微波輔助和有機溶劑相結(jié)合的方法提取黑枸杞中花青素，根據(jù)單因素試驗結(jié)果和Box-Behnken Design[8]試驗進行提取工藝的優(yōu)化，以此提高黑枸杞中花青素的提取率，為黑枸杞花青素的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　儀器

JA1003型電子分析天平(廣州市典銳化玻實驗儀器有限公司)；721可見分光光度計(無錫久平儀器有限公司)；真空泵(上海真空泵有限公司)；XH-800G型超聲微波合成反應(yīng)儀(南京貝蒂儀器有限公司)；HHS-4水浴鍋四孔(金壇市金城碩華儀器廠)；粉碎機(鄭州九工機械設(shè)備有限公司)；XR-100型恒溫干燥箱(臨朐縣旭日干燥設(shè)備廠)。

1.2　材料與試劑

黑枸杞(青海康普生物科技股份有限公司)；無水乙醇、甲醇、丙酮、石油醚、硫酸銅、氯化鉀、氯化鐵(均為分析純)。

1.3　黑枸杞花青素的提取

1.3.1預(yù)處理(1)取一定數(shù)量的黑枸杞，將黑枸杞放在50 ℃的干燥箱中，進行干燥，直到黑枸杞的重量不再發(fā)生變化取出。溫度降到室溫后，用粉粹機將黑枸杞進行粉碎，放在60目的篩子中過篩，最后放于干凈的瓶中保存。(2)脫脂：在黑枸杞粉末中，加入一定量的石油醚(1∶10)，震蕩半個小時，使脂肪充分溶解，降低黑枸杞中脂肪的含量，真空抽濾，干燥，儲存起來備用。

1.3.2工藝流程稱取預(yù)處理后的黑枸杞粉末→加入有機溶劑→恒溫水浴鍋加熱30 min→微波提取→抽濾→轉(zhuǎn)移至容量瓶→定容→測吸光度→計算花青素提取率。

1.3.3操作方法將預(yù)處理后的黑枸杞粉末，精密稱取1.0 g置于錐形瓶中，按試驗預(yù)設(shè)定的料液比加入料液比1∶20的有機溶劑，放入超聲微波合成儀器中，調(diào)整微波功率為200 w，微波時間120 s，轉(zhuǎn)入到50 mL容量瓶中，定容，即得花青素提取液。

1.3.4定性試驗將處理的花青素溶液，通過高效液相色譜儀，得到譜圖，與花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液的譜圖進行比較，在525 nm處有峰，說明提取液中有花青素。

1.3.5黑枸杞中花青素提取率的測定(1)花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立精確稱取0.3 g黑枸杞色素，加入70%乙醇溶液，定容于100 mL容量瓶中，分別吸取6，8，10，12，14 mL轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用70%的乙醇溶液定容，配置成濃度為0.36，0.48，0.60，0.72，0.84 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在525 nm處測得吸光度[10]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1，確定了以黑枸杞花青素為標(biāo)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.59923x—0.01238，R=0.9994，其中y為實驗所得的吸光值(ABS)，x為樣品濃度(mg·mL-1)，由實驗數(shù)據(jù)表明，此方程具有良好的線性關(guān)系。(2)計算公式提取率(%)=(C×V)/M×1000×100%。C：測得樣品溶液中花青素濃度(mg/mL)；V：定容之后溶液的體積(mL)；M：樣品質(zhì)量(g)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1　試驗設(shè)計因素與水平

圖2 不同有機溶劑對提取率的影響

圖3 微波功率對花青素提取率的影響

1.4　采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

根據(jù)黑枸杞中提取花青素的五個因素的試驗結(jié)果，選擇其中三個對提取率影響比較大的因素進行試驗，利用響應(yīng)面軟件，優(yōu)化提取黑枸杞中花青素的條件，確定最佳的提取工藝，進一步確定提取黑枸杞中花青素的最佳提取率。響應(yīng)面分析方案見表1。

2　結(jié)果與分析

2.1　有機溶劑的選擇

選取有機溶劑的種類：乙醇，甲醇，丙酮。分別精密稱取1.0 g黑枸杞置于三個錐形瓶中，按試驗預(yù)設(shè)定的料液比加入料液比1∶20，濃度為70%的乙醇，甲醇，丙酮，調(diào)整微波功率為200 w，微波時間120 s，轉(zhuǎn)入到50 mL容量瓶中，定容，即得花青素提取液，測得其吸光度值。

由圖2可以看出，提取率按從高到低的順序依次為：乙醇>丙酮>甲醇，所以在接下來的試驗中選取乙醇作為提取劑。

2.2　單因素試驗結(jié)果

2.2.1微波功率對黑枸杞花青素提取率的影響從圖3可知，折線圖的趨勢是先上升后下降，在200 W時，提取率達到最大。原因可能是，在適宜的范圍內(nèi)，隨著超聲微波合成儀的功率的升高，黑枸杞中花青素溶液的溫度上升，提取率變大。但當(dāng)微波功率超過250 W時，由于溫度過高，破壞了花青素的結(jié)構(gòu)，隨之提取率下降。

2.2.2料液比對黑枸杞花青素提取率的影響從圖4知，在1∶10-1∶20之間，隨著料液比的增加，提取率也在相應(yīng)的變大。當(dāng)料液比超過1∶20時，提取率保持平穩(wěn)?？赡芤驗殡S著料液比的增加，黑枸杞中的花青素在乙醇溶液中溶解的越充分，提取率也會提高。但當(dāng)料液比為1∶20時，花青素已經(jīng)充分溶解到溶劑中，隨著料液比的增加，溶解情況也不會發(fā)生改變。為了節(jié)省資源，故采用料液比為1∶20。

圖4料液比對花青素提取率的影響圖5微波時間對花青素提取率的影響圖6乙醇濃度對花青素提取率的影響圖7pH值對花青素提取率的影響

2.2.3微波時間對黑枸杞花青素提取率的影響從圖5可知，當(dāng)微波時間為150 s時，黑枸杞中花青素的提取率最大。折線圖的趨勢是先上升后下降。原因可能是，在適宜的微波功率范圍內(nèi)，隨著時間的加大，花青素提取液的溫度相應(yīng)的升高，隨著溫度升高而分解，提取率降低。故采用微波時間為150 s。

2.2.4乙醇濃度對黑枸杞花青素提取率的影響從圖6可知，折線圖呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。造成折線圖呈現(xiàn)這種趨勢的原因可能是，由于乙醇溶液的濃度不同，其溶液的極性也會發(fā)生改變。在70%時達到了最佳的效果。

2.2.5pH值對黑枸杞花青素提取率的影響由圖7可以看出，當(dāng)pH=3時，黑枸杞中花青素的提取率最大。造成這種現(xiàn)象的原因可能是，當(dāng)pH=1時，由于溶液的酸度太大，破壞了花青素的結(jié)構(gòu)。當(dāng)pH=5時，酸度下降的太大，不利于花青素的存在。在pH>7時，幾乎全部破壞了花青素的結(jié)構(gòu)。故提取液的pH值應(yīng)為3。

2.3　響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

2.3.1回歸方程的建立與分析采用軟件Design-Expert8.0.6.1中的Box-Benhnken試驗設(shè)計的原理，通過上面單因素試驗所得到的信息，選擇微波功率、時間、乙醇濃度等三個因素進行試驗，其響應(yīng)值為提取率。試驗方案及結(jié)果見表2。

表2　微波輔助有機溶劑提取黑枸杞中花青素試驗方案與結(jié)果

響應(yīng)面方差分析見表3。利用Design-Expert8.0.6.1軟件對表1數(shù)據(jù)進行分析，建立如下二次方程：

R=2.18000-0.018750A-0.012500B-0.056250C-0.17500AB+0.012500AC+0.025000BC-0.18375A2-0.17125B2-0.10875C2。

該方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9398，AdjR2=0.9048，模型擬合度良好。由表3可以看出，整體模型達到了極顯著水平(P<0.01)，表示這個二次方程模型極顯著，不同處理間的差異程度顯著。失擬項(P=0.1568)說明模型選擇合適。

表3　響應(yīng)面方差分析

由表3可以看出，AB、A2、B2達到了極顯著水平，交互項影響也達到了極顯著水平。所以響應(yīng)值的變化相當(dāng)復(fù)雜，各項具體試驗因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，而是呈二拋物面關(guān)系。由表3中的顯著性可以看出，對花青素提取率影響的因素按從大到小的順序依次為微波功率>微波時間>乙醇濃度。

2.3.2響應(yīng)面及等高線的分析結(jié)果由于交互作用對黑枸杞中花青素提取率的影響，所以，在保持一個因素?zé)o變化的情況下，對模型進行降維分析。利用Design-Expert8.0.6.1軟件，根據(jù)上述回歸方程分析作出響應(yīng)面圖和等高線圖(圖8-圖10)。從下面的三組圖中可知，兩兩交互作用由大到小依次為微波功率和微波時間，微波功率和乙醇濃度，微波時間和乙醇濃度。

圖8 微波功率和微波時間對花青素提取率的影響的等高線及響應(yīng)面圖

圖9 微波功率和乙醇濃度對花青素提取率的影響的等高線及響應(yīng)面圖

圖10 微波時間和乙醇濃度對花青素提取率的影響的等高線及響應(yīng)面圖

圖11 光照時間對花青素穩(wěn)定性的影響

圖12 溫度對花青素穩(wěn)定性的影響

圖13 不同金屬離子對花青素穩(wěn)定性的影響

圖14 不同pH對花青素穩(wěn)定性的影響

2.3.3提取工藝的優(yōu)化及結(jié)果驗證為了進一步確定最佳的提取條件，用軟件Design-Expert8.0.6.1進行優(yōu)化分析，以得到提取黑枸杞中花青素的最優(yōu)條件。經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化分析后，確定的最優(yōu)條件為微波功率146 w，微波時間116.4 s，乙醇濃度64.8%，此時花青素的提取率為2.18%。由于確定的最佳條件的數(shù)據(jù)在實際操作中不方便操作，決定將提取條件改為：微波功率146 W，微波時間116 S，乙醇濃度65%。采用改正后的工藝條件進行3次平行試驗，得到黑枸杞花青素提取率為2.15%，與模型預(yù)測性相差不大，證明這個模型具有一定的可靠性。

2.4黑枸杞中花青素穩(wěn)定性的研究

2.4.1光照對花青素穩(wěn)定性的影響取5 mL的花青素濃縮液，放在日光的條件下，每隔2 h測定其吸光度。

如圖11所示，可以得知，光照對花青素的穩(wěn)定性有顯著的影響。隨著光照時間的增加，吸光值在不斷地下降，即說明花青素的含量降低，故花青素應(yīng)該避光保存。

2.4.2 溫度對花青素穩(wěn)定性的影響分別取5 mL的花青素濃縮液，放在30 ℃，50 ℃，70 ℃，100 ℃的恒溫水浴鍋上30 min，測定其吸光度值。

如圖12所示，可以看出，當(dāng)溫度高于70℃時，花青素的含量明顯的下降，說明溫度對花青素的影響比較大。所以應(yīng)該在低溫的環(huán)境中保存花青素。

2.4.3不同金屬離子對花青素穩(wěn)定性的影響分別取5 mL的花青素濃縮液，分別加入1 mL的濃度為0.1 mol/L的硫酸銅，氯化鉀，氯化鐵溶液，每隔2 h測定其吸光度值。

如圖13所示，三種不同的金屬離子對花青素穩(wěn)定性影響強度的順序依次為Cu2+>K+>Fe3+。所以，在保存花青素時應(yīng)遠離金屬離子。

2.4.4不同pH值對花青素穩(wěn)定性的影響分別取5 mL的花青素濃縮液，分別調(diào)節(jié)花青素溶液的pH值為1.0，3.0，5.0，7.0，9.0，測定其吸光度值。

如圖14所示，當(dāng)pH在1-3的范圍時，由于pH=1時，酸度較高，破壞了花青素的結(jié)構(gòu)，所以吸光度值降低。當(dāng)pH>3時，隨著pH值的增加，花青素的吸光度值不斷下降。故最好在酸性條件下保存花青素。

3　結(jié)　論

采用微波輔助和有機溶劑相結(jié)合的方法對黑枸杞中的花青素進行試驗，通過五個因素的單因素試驗，利用響應(yīng)面，對微波功率、微波時間、乙醇濃度三個因素進行響應(yīng)面分析。分析結(jié)果表明，上述的因素對黑枸杞中花青素的提取率有顯著的影響。模型擬合程度高，誤差小。響應(yīng)面優(yōu)化法確定黑枸杞在微波功率為146 w，乙醇濃度為65%、微波時間116 s的條件下，提取黑枸杞中花青素的提取率為2.15%，和模型中的預(yù)測值2.18%相差不大，結(jié)果可靠。

經(jīng)過對黑枸杞中花青素的穩(wěn)定性研究后，環(huán)境因素能夠造成花青素結(jié)構(gòu)的改變，使花青素不穩(wěn)定。所以花青素應(yīng)避光、低溫保存，酸性條件下，遠離金屬離子。

參考文獻：

[1] 甘青梅，左振常，昌也平，等.藏藥“旁瑪”的考證及生藥學(xué)研究[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志，1995(12)：31-33.

[2] 《新疆植物志》編輯委員會.新疆植物志[M].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1993.

[3] 劉勇民，沙吾提伊克木.維吾爾藥志[M].新疆人民出版社，1986.

[4] 朱曉雙，劉春燕，楊振，等.花青素合成關(guān)鍵酶基因的定位及結(jié)構(gòu)分析[J].大豆科學(xué)，2011，30(1)：24-28.

[5] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志第六十七卷第一分冊[M].科學(xué)出版社，1978.

[6] Wangl S，Kuoc T，Chos J.Black raspberrys-derived anthocyanins demethylate tumor Suppressor genes through theinhibition of DNMT 1 and DNMT3B in colon cancer cells[J].Nutrition and Cancer，2013，65(1)：118-125.

[7] Liu Yi xiang，Zhang Di，Wu Yong pei，et al.Stability and absorption of anthocyanins from blueberries subjected to a siumulated digestion process[J].Food Composition and Analysis，2014，65(4)：440-480.

[8] 李瑞麗，馬瑞宇.微波輔助提取葡萄籽原花青素的工藝研究[J].糧食與食品工業(yè)，2008，15(1)：33-37.