川崎病并發(fā)冠脈損傷患兒血清活化HUVECs NF- κB促使MMP- 9 mRNA水平上調(diào)的實驗研究*

劉麗莎，李喆倩，談　誠，于漢卿

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗科，南京　210008)

川崎病(kawasaki disease，KD)，又稱皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征(mucocutaneous lymph node syndrome，MCLS)，是一種好發(fā)于5歲以下兒童的急性自限性全身性血管炎性疾病，是嬰幼兒后天性心臟病最主要的致病原因[1]，其發(fā)病率呈逐年升高趨勢[2，3]。目前KD病因尚不明確，研究表明感染因素作用下炎癥因子誘發(fā)的免疫系統(tǒng)功能紊亂與KD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4，5]。先前實驗發(fā)現(xiàn)，KD急性期患兒外周血單個核細(xì)胞中核因子- κB(NF- κB)和基質(zhì)金屬蛋白酶- 9(MMP- 9)表達(dá)上調(diào)[6]，KD并發(fā)冠脈損傷患兒血清能誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs NF- κB)的活化并可使MMP- 9分泌增加，而抑制NF- κB的活化可有效降低MMP- 9的表達(dá)水平，表明NF- κB可通過上調(diào)MMP- 9的表達(dá)在KD并發(fā)冠脈損傷中發(fā)揮了一定的作用[7]，但二者具體的機制尚未明確，本實驗將繼蛋白水平之后，在轉(zhuǎn)錄翻譯水平對NF- κB和MMP- 9的關(guān)系進(jìn)行深入探討。

1　材料和方法

1.1材料人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)株購自上海中喬新舟生物科技有限公司；NF- κB p65單克隆抗體購自Cell Signaling公司；免疫共沉淀(ChIP)檢測試劑盒購自美國millipore公司；引物設(shè)計由英駿生物完成。

1.2血清制備36例在本院確診為KD的患兒，其中21例未并發(fā)CALs，15例并發(fā)CALs；19例急性上呼吸道感染患兒以及20例在保健科體檢的健康兒童，各組年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。分別采集以上各組兒童靜脈血3 ml，分離血清，凍存待用。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)取傳代培養(yǎng)的HUVECs分為4組：正常血清組(Control組)、發(fā)熱血清組(F組)、無冠狀動脈損傷組(non- CALs組)和冠狀動脈損傷組(CALs組)，分別用含10 ml/dl正常血清、10 ml/dl急性發(fā)熱患兒血清、10 ml/dl無冠狀動脈損傷KD患兒血清和10 ml/dl并發(fā)冠脈損傷KD患兒血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

1.4ChIP實驗取上述各組處理后的細(xì)胞，按說明書進(jìn)行操作，大致操作步驟為超聲裂解DNA- NF- κB p65抗體進(jìn)行免疫共沉淀，形成Protein A agarose/antibody/histone復(fù)合物- 軟件篩選的MMP9啟動子引物進(jìn)行PCR擴增分析，引物序列為：3’CACTTCAAAGTGGTAAGA5’；5’GAAAGTGATGGAAGACTCC3’。

1.5MMP- 9 mRNA水平測定抽提各處理組HUVECs總RNA，RT- PCR法測定MMP- 9 mRNA水平，引物序列為：MMP- 9(sense 5’- CCT GGA GAC CTG AGA ACC AAT CT- 3’，antisense 5’- CCA CCC GAG TGT AAC CAT AGC- 3’)；GAPDH(sense 5’- CCA CCC ATG GCA AAT TCC ATG CA- 3’，antisense 5’- TCT AGA CGG CAG GTC AGG TCC ACC- 3’)。

2　結(jié)果

2.1ChIP與對照組相比，Non- CALs組和CALs組細(xì)胞處理后，用NF- κB p65抗體沉淀下來的DNA片段可用預(yù)先設(shè)計的針對MMP- 9啟動子上特定片段的引物擴增出片段，說明在KD患兒血清作用下，HUVECs中NF- κB 可以直接結(jié)合在MMP- 9啟動子上，見圖1。

圖1　各組HUVECs NF- κB p65與MMP- 9結(jié)合情況

2.2RT- PCR與對照組相比，CALs組和non- CALs組HUVECs MMP- 9 mRNA水平上調(diào)，說明NF- κB結(jié)合在MMP- 9啟動子上促進(jìn)了其轉(zhuǎn)錄，見圖2。

圖2　各組MMP- 9 mRNA水平

3　討論

KD是嬰幼兒常見的以全身血管炎為主要病變的病因未明的免疫相關(guān)性炎性疾病，特征為廣泛的中小血管炎癥，以心血管系統(tǒng)的損害最為嚴(yán)重，其發(fā)病機制尚未明確，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷與功能障礙是血管炎發(fā)生的始動環(huán)節(jié)，多種信號通路涉及其中[8～10]。

本課題組前期研究從蛋白水平研究了HUVECs在KD急性期和并發(fā)CALs患兒血清作用下NF-κB和MMP- 9的表達(dá)情況[6，7]。本實驗對使用KD并發(fā)CALs患兒血清處理HUVECs后，NF- κB p65和MMP- 9表達(dá)量上調(diào)進(jìn)行了更為深入地研究，結(jié)果顯示在血清作用下，NF- κB可直接結(jié)合在MMP- 9啟動子上促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄水平的增加，對之前實驗結(jié)果進(jìn)行了驗證，表明在始發(fā)因素的作用下，NF- κB/MMP- 9表達(dá)上調(diào)在KD并發(fā)CALs患兒血清誘導(dǎo)的HUVECs病變中發(fā)揮作用。這為進(jìn)一步研究涉及的上下游信號通路奠定了基礎(chǔ)，也為臨床尋求KD并發(fā)CALs新的診斷標(biāo)記和藥物治療靶點提供了理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Kowalczyk M，Turska- Kmiec A，Ziólkowska L，et al．Symptoms，diagnosis and characteristic abnormalities in the coronary arteries in Kawasaki disease in children[J]．Med Wieku Rozwoj，2010，14(4)：344- 349．

[2]談?wù)\，殷絲雨，李喆倩，等．江蘇省南京市2012～2014年川崎病流行病學(xué)調(diào)查[J]．中國基層醫(yī)藥，2015，22(21)：3249- 3251．

Tan C,Yin SY,Li ZQ,et al.Epidemiological study of children with kawasaki- disease in Nanjing of Jiangsu Province from 2012 to 2014[J]．Chin J Prim Med Pharm，2015，22(21)：3249- 3251．

[3]Sano T，Makino N，Aoyama Y，et al．Temporal and geographical clustering of Kawasaki disease in Japan:2007～2012[J]．Pediatr Int，2016，58(11):1140- 1145．

[4]Hara T，Nakashima Y，Sakai Y．Kawasaki disease： a matter of innate immunity[J]．Clin Exp Immunol，2016,186(2):134- 142．

[5]Dimitriades VR，Brown AG，Gedalia A．Kawasaki disease： pathophysiology，clinical manifestations，and management[J]．Curr Rheumatol Rep，2014，16(6)：423．

[6]劉麗莎，朱純亮，韓勍，等．川崎病患兒血清活化HUVECs NF- κB并促進(jìn)MMP- 9分泌[J]．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2015，35(1)：99- 100．

Liu LS,Zhu CL,Han Q,et al.Serum activation of HUVECs NF- κB and MMP- 9 secretion in children with kawasak- disease[J]．Basic & Clinical Medicine，2015，35(1)：99- 100．

[7]朱純亮，韓勍，韓晶晶，等．川崎病合并冠狀動脈損傷患兒血清對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NF- κB和MMP- 9表達(dá)的影響[J]．江蘇醫(yī)藥，2015，41(20)：2407- 2409．

Zhu CL Han Q,Han JJ,et al.Effect of serum from kawasaki disease children with coronary artery lesions on expressions of NF- κB and matrix metalloproteinase- 9 in human umbilical with endothelial cells[J]．Jiangsu Med J，2015，41(20)：2407- 2409．

[8]Lee Y，Wakita D，Dagvadorj J，et al.IL- 1 signaling is critically required in stromal cells in kawasaki disease vasculitis mouse model：role of both IL- 1α and IL- 1β[J]．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2015，35(12)：2605- 2616．

[9]靳劍蕓，李啟亮，宋文琪．血漿血栓彈力圖與抗凝血酶Ⅲ檢測對兒童川崎病診斷的應(yīng)用價值[J]． 現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2017，32(2)：130- 132．

Jin JY，Li QL，Song WQ．Correlation discussion of blood plasma thromboelastography values and antithrombin Ⅲ level in chidren’s kawasaki disease[J]．J Med Lab Med，2017，32(2)：130- 132．

[10]馬樂，杜忠東．川崎病血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷機制的研究進(jìn)展[J]．中華兒科雜志，2016，54(2)：158- 160．

Ma L，Du ZD．Advances in the mechanism of vascular endothelial cell injury in kawasaki disease[J]．Chinese Journal of Pediatrics，2016，54(2)：158- 160．