免疫比濁法測定尿液游離血紅蛋白的方法學研究*

朱海波，尹　伶，王　新，嚴念道，鄧建平

(1.黃石市愛康醫(yī)院檢驗科，湖北黃石　435000；2.武漢科技大學醫(yī)學院，武漢　430081)

人體血紅蛋白正常分布于血液的紅細胞內(nèi)，紅細胞代謝凋亡后血紅蛋白呈游離狀態(tài)釋放入血液，故健康人群血漿中存在大約有50mg/L的游離血紅蛋白，但尿液中游離血紅蛋白含量極低。當血紅蛋白量超過結合珠蛋白的結合能力時，血漿游離血紅蛋白經(jīng)腎小球濾出，當超1.00～1.35 g/L時，血紅蛋白可隨尿液排出，即可出現(xiàn)血紅蛋白尿。此外，當某些病理情況下血管破損或通透性發(fā)生改變時，紅細胞可經(jīng)血管壁進入周圍組織釋放出血紅蛋白，此時在相關標本中可檢測到游離血紅蛋白存在。醫(yī)學實驗室對微量的游離血紅蛋白的檢測亦稱為隱血試驗或潛血試驗，是臨床用于出血性或溶血性疾病鑒別診斷時最為常用的檢查項目之一[1～21]，現(xiàn)有的方法學多為定性實驗或半定量實驗。目前實驗室常用的檢測方法主要有比色法、化學法和金標法，目前尿液潛血主要以化學法(干化學)為主。本實驗室應用免疫透射比濁法原理設計了用于尿液游離血紅蛋白的檢測方法，旨在建立一種檢測性能良好、并可實現(xiàn)自動化定量的方法應用于普通生化分析儀上，以解決現(xiàn)有方法學的不足。本研究內(nèi)容經(jīng)權威醫(yī)學情報機構查新，國內(nèi)外均未見報道。

1　材料與方法

1.1研究對象

1.1.1性能評價試驗樣本來源：在本實驗室已完成檢測的臨床尿液標本中隨機抽取干化學潛血試驗為(±)和(2+)的新鮮標本各20份，將相同結果的樣本離心取上清液等量混合，分別制備成低、高兩種濃度的混合尿液標本S低，S高；另選取20份潛血試驗為(-)并經(jīng)膠體金方法確認的樣本離心取上清液等量混合，作為空白樣品。

1.1.2建立生物參考區(qū)間樣本來源：在本院體檢中心遴選常規(guī)體格檢查健康、經(jīng)尿液干化學測定潛血為陰性的受試者，剔除標準包括泌尿系統(tǒng)疾病或損傷、溶血性疾病、出血性疾病、高血壓、高膽紅素血癥、女性受試者應避開月經(jīng)期等，將可能影響參考值客觀性的對象剔除，最終納入本項測試的人數(shù)男性147例、女性162例；收集每位受試者新鮮尿液標本10 ml，以3 000 r/min離心5 min后取上清液用于生物參考區(qū)間的建立；在本院皮膚科、眼科的門診患者中按上述剔除標準篩選男性、女性受檢者各30例收集尿液標本，用于生物參考區(qū)間的驗證。

1.2儀器和試劑

1.2.1儀器：東芝TBA- 120FR全自動生化分析儀、Beckman LH750全自動血細胞分析儀。

1.2.2試劑

1.2.2.1檢測試劑原料：抗人血紅蛋白單克隆抗體8 mg/ml，lot20151024(上海遼元生物)，聚苯乙烯羧基膠乳微球Estapor- 80nm(重慶中元)。

1.2.2.2檢驗試劑制備：

1.2.2.2.1試劑I：稱取Tris 12.1 g加入800 ml ddH2O中充分混勻，調(diào)節(jié)pH至8.0；稱取BSA 5 g溶于上述緩沖液中充分攪拌混勻；稱取PEG8000 25 g溶于上述溶液中充分攪拌混勻；取PC300 1 ml加入上述液體中，加入ddH2O定容至1 L，加入0.1 mg/dl EDTA和防腐劑后密封貯存，備用。

1.2.2.2.2試劑II：將血紅蛋白抗體進行4℃透析，透析液為50 mmol/L的PBS液；將80nm聚苯乙烯羧基膠乳微球用蒸餾水洗滌離心，重復3次；取上述處理的微球液1 ml，加50 mmol/L，pH5.8的MES buffer緩沖液，攪拌均勻；分別稱取EDC，NHS 1 ml，加入其中攪拌均勻；加入血紅蛋白抗體500 μl，攪拌反應過夜；稱取BSA 50 mg加入反應，再取5 μl乙醇胺加入其中，終止反應；離心洗滌：20 000 r/min離心30 min，去除上清；重懸：取PBS buffer 10 ml，使沉淀懸??；超聲處理：將試劑采用細胞破碎儀進行超聲處理，使膠乳顆粒分散均勻，加入0.1 mg/dl EDTA和防腐劑后密封貯存，備用。

1.2.2.3回收試驗：人血紅蛋白標準品H7379，1 g/支(北京北納創(chuàng)聯(lián))。

1.2.2.4干擾試驗：游離膽紅素(FBil)(百靈威公司生產(chǎn)，批號L9BOL34)，結合膽紅素(CBil)(百靈威公司生產(chǎn)，批號JHll- 5491)，維生素C(華瑞制藥，批號SLBC7863V)，中/長鏈脂肪乳注射液(C6- C24，華瑞制藥，批號80DH066)，動物血紅蛋白(自制)。

1.3方法

1.3.1參數(shù)設置及定標：按TBA120生化分析儀操作程序進行參數(shù)設置；載入已制備的膠乳比濁法試劑；將人血紅蛋白標準品H7379用ddH2O配制成1 000 mg/L，500 mg/L，250 mg/L，125 mg/L和0 mg/L的濃度系列進行定標；完成后觀察標準曲線，包括對定標點偏離、定標曲線平滑程度、定標因子等；記錄各校準點吸光度變化值，并用CORREL函數(shù)作相關性分析。

1.3.2回收試驗：將1 000 mg/L的人血紅蛋白標準液用空白樣品稀釋成濃度為100 mg/L和500 mg/L的兩種標準液；將兩種標準液分組加入S低，S高，按回收試驗程序分別載入全自動生化儀進行游離血紅蛋白檢測，并計算不同樣品濃度水平、不同加入物濃度下的回收率U。

1.3.3精密度試驗：參照CLSI EP5- A2文件，以混合尿液標本S低，S高作為精密度試驗樣本，分裝-20℃冷凍保存；定標后，每日分兩個批次、每批次重復2次，分別檢測尿液標本S低和S高，并記錄結果；按下述方法計算S低和S高兩個濃度水平下的室內(nèi)精密度CV：

其中I=總的運行天數(shù)(有兩個批次)；Xi1=第i日第1批運行結果的均值；Xi2=第i日第2批運行結果的均值；該公式不適用于某一日僅有一個批次的數(shù)據(jù)的計算。

其中：I=總的運行天數(shù)；Xi=第i日所有結果的均值；X=所有結果的均值。

其中：Srr=批間標準差的評價

通過該公式將會獲得與通過所有觀測值所計算的標準差不同的ST。上面的公式是評價儀器精密度的正確方法，因為它恰當?shù)钠胶饬酥貜托砸约叭臻g和批間的成分。精密度評價的變異系數(shù)CV為檢測物的濃度除ST再乘以100，結果以百分比表示。

1.3.5線性試驗：參照CLSI EP6- A文件，將人血紅蛋白標準品H7379用空白樣品配制成濃度為1 000 mg/L的溶液，按表1稀釋方案配制成系列濃度梯度；如果濃度1 000 mg/L的樣本仍在線性范圍內(nèi)，需制備更高濃度的溶血樣本重新尋找線性的cut值；如果10%稀釋濃度以上的樣本均不在線性范圍內(nèi)，需制備更高稀釋倍的梯度樣本重新尋找線性cut值；將稀釋后的系列濃度的樣本依次上機檢測，每個樣本重復檢測2次獲得均值；將線性試驗偏差的目標設定為預期值的±5%，將每個樣本的檢測結果按下式進行計算得到點偏差T，如果>5%則判斷為超出線性范圍：T=(Xn-Yn)/Yn，其中：Xn表示梯度樣本中第n個點的測定值；Yn表示梯度樣本中第n個點的預期值。

表1 線性試驗樣本稀釋程序

1.3.6干擾試驗：參照CLSI EP7- A2文件，分別使用S低和S高作為基礎樣本，用基礎樣本以1∶20比例分別稀釋 5種干擾物貯存液、空白樣品作測試和對照樣本，稀釋后測試樣本中游離膽紅素、結合膽紅素、維生素C、乳糜濃度、動物血紅蛋白分別是342 μmol/L，342 μmol/L，0.03 g/L，1 450 FTU，500 mg/L；計算最大允許干擾值(dmax)/批內(nèi)標準差(s)比值，查dmax/s與重測次數(shù)對應表，得出2個濃度水平重復測定次數(shù)，其中s由基礎樣本重復測定10次計算而得，dmax為各項目臨床意義差別標準，本研究設定尿液游離血紅蛋白的dmax為基礎樣本均值的10%；對測定數(shù)據(jù)進行干擾效應的點估計，即測試樣本與對照樣本的測定均值之差(dobs)與臨界值(dc)進行比較，若點估計dobs>dc則說明存在干擾；對于存在干擾的項目，對干擾物貯存液分別以10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%比例稀釋后再重新進行干擾實驗，以確定該方法抗干擾的最大濃度值。

1.3.7建立生物參考區(qū)間并驗證

1.3.7.1建立生物參考區(qū)間：定標后檢測男、女兩組受試者尿液樣本中游離血紅蛋白濃度并記錄結果；對兩組結果進行正態(tài)分布Shapiro- Wilk檢驗(W檢驗)，如果資料呈偏態(tài)分布，采用第99百分位值作為參考值上限；如果資料呈正態(tài)分布則取95%置信區(qū)間作為參考值范圍。兩組間參考值差異性比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.3.7.2生物參考區(qū)間驗證：對驗證樣本進行尿液游離血紅蛋白檢測，計算處于參考區(qū)間內(nèi)的樣本百分比。

1.4統(tǒng)計學分析分別按照性能評價試驗要求，應用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2　結果

2.1參數(shù)設置及定標曲線

2.1.1項目參數(shù)：本方法在東芝TBA120全自動生化分析儀上的參數(shù)設置見表2。

2.1.2定標曲線：定標為通過狀態(tài)；定標曲線符合平滑的拋物線形態(tài)，經(jīng)logit- log線性回歸成直線后，吸光度值(Y)與定標液濃度(X)的回歸方程為Y=3 527X+8.897；定標液濃度與吸光度值經(jīng)相關性分析，r=0.980 7>0.975，r2=0.961 8>0.95，呈高度相關。

表2 膠乳增強免疫比濁法測定尿液游離血紅蛋白在TBA120上的參數(shù)設置

2.2方法學性能評價

2.2.1回收試驗：S低加入濃度為100mg/L和500mg/L的回收率分別為95.3%和102.7%；S高加入濃度為100 mg/L和500 mg/L的回收率分別為104.2%和103.5%，兩組樣本加入不同濃度標準液后的回收率U均介于95%～105%區(qū)間內(nèi)。

2.2.2精密度試驗：低值樣本S低和高值樣本S高的總不精密度CV分別的6.52%和4.18%。

2.2.3靈敏度試驗：本方法檢測的分析靈敏度為2.8 mg/L。

2.2.4線性試驗：本方法檢測的線性范圍為0～1 100.0 mg/L。

2.2.5干擾試驗：當樣本中游離膽紅素、結合膽紅素、維生素C、動物血紅蛋白分別小于342 μmol/L，342 μmol/L，0.03 g/L，500 mg/L時對本試驗結果無干擾；當乳糜濃度>870 FTU時對本試驗結果有顯著干擾；其抗干擾性能接近本實驗室臨床化學常規(guī)項目水平。

2.3生物參考區(qū)間及驗證

2.3.1納入的研究對象經(jīng)剔除標準篩選后，用于參考值統(tǒng)計的男性樣本數(shù)為147例、女性樣本數(shù)為162例；W檢驗P<0.05，呈均偏態(tài)分布；采用第99百分位值作為生物參考區(qū)間上限，男性生物參考區(qū)間為0～13.3 mg/L、女性生物參考區(qū)間為0～17.1 mg/L；男性與女性的參考范圍經(jīng)t檢驗，t=1.129，P>0.05，無顯著性差異。

2.3.2兩組驗證樣本的檢測結果均落在本次建立的生物參考區(qū)間范圍內(nèi)。

3　討論

醫(yī)學實驗室對血紅蛋白的檢測最初是源于全血標本，方法學大致分為4類，即全血鐵法、比密法、血氣分析法和比色法，其中以比色法最為常用，是利用血紅蛋白衍生物的光譜特征進行測定。血紅蛋白在正常尿液標本中含量極低，病理狀態(tài)下尿液中雖可出現(xiàn)大量血紅蛋白，但其絕對值仍較低，采用常規(guī)的測定方法其靈敏度遠不能滿足尿液標本的性能要求。多年來，國內(nèi)外學者對尿液游離血紅蛋白測定的方法學進行了眾多研究，主要有試帶法(干化學法)、比色法和免疫法三類，方法學性能各有差異[22]。

為了解決尿液游離血紅蛋白檢測的靈敏度、特異度、數(shù)值化檢測等問題，本課題組設計了基于免疫法原理的膠乳增強免疫比濁法。該方法選擇的抗HBA0抗體是人類血紅蛋白中最主要、最穩(wěn)定的組分[23～25]，保證了方法學的特異性。本方法的參數(shù)設置參考了臨床化學檢驗中的同類型項目，如尿液MAlb、尿液β2- M等，并在此基礎上進行了調(diào)整，以保證方法學達到預期的性能。研究結果顯示定標曲線呈良好的拋物線形態(tài)、各測定點較定標曲線無明顯偏離、被測物濃度與測試響應程度(吸光度值)之間呈高度相關，該項數(shù)據(jù)是證實方法學是否成立的最關鍵依據(jù)。在進行正確度評價方面值得注意的是，膠體金法雖然可作為潛血試驗的確證方法[22]，但目前僅限于定性試驗；試帶法和比色法雖然靈敏度較高，但特異度較差，且均為定性或半定量試驗；雖然國內(nèi)外有報道使用散射比濁法專用儀器進行隱血定量檢測[26～30]，但該儀器僅限于糞便標本的檢測，其方法學性能是否適用于尿液或其他類型標本檢測尚未明確，因此現(xiàn)有的方法學均不宜作為參考系統(tǒng)對本方法學進行準確度的評價。本研究中選擇了以回收試驗作為正確度評價試驗，通過對加入標準品的測定結果與預期值的符合性進行判斷，客觀反映本方法學的準確度。本研究中方法學性能評價分別參照CLSI(美國臨床實驗室標準化協(xié)會批準指南)的EP5- A2，EP17- A，EP6- A，EP7- A2等指南性文件進行試驗，性能評價試驗結果表明該方法檢測性能接近本實驗室臨床化學常規(guī)項目的水平，具備檢測臨床尿液標本的能力。

此外，游離血紅蛋白檢測在臨床其他類型標本中亦應用極為廣泛，包括糞便、胃液、血漿、漿膜腔積液、腦積液、唾液等，其中部分標本尚未找到理想的方法學，因此本研究的數(shù)據(jù)為膠乳增強免疫比濁法檢測游離血紅蛋白在其他類型標本中的應用提供了新的思路和參考依據(jù)。

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