人血清幽門螺桿菌SodB抗體檢測與胃癌發(fā)生的相關(guān)性研究*

田文靜，劉電力，劉惠敏，范　清，謝文珍，東英子　

(1.哈爾濱醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，哈爾濱　150081；2.哈爾濱醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，哈爾濱　150001；3.哈爾濱市香坊區(qū)疾病預防控制中心，哈爾濱　150046)

世界衛(wèi)生組織在2012年公布的調(diào)查報告中顯示，胃癌是一種多發(fā)于東亞地區(qū)的常見惡性腫瘤[1]。在中國，雖然胃癌發(fā)病率和死亡率近年來均呈下降趨勢[2]，但在2017年發(fā)布的中國惡性腫瘤報告中顯示，2013年我國胃癌發(fā)病率在255種登記癌癥中居第二位，是男性第二及女性第四常見的惡性腫瘤，是男性第三位及女性第二位癌癥死亡原因。且在低、中、高度城市化地區(qū)胃癌的發(fā)病率和死亡率均較高[3]。由于其預后較差，因此選取一種簡便、無痛苦、盡可能準確的方式進行早期篩查，是十分必要的。

由H.pylori基因組編碼產(chǎn)生的鐵輔因子超氧化物歧化酶(iron- cofactored superoxide dismutase，SodB)在幽門螺桿菌定植宿主胃黏膜的過程中起到重要作用，是影響幽門螺桿菌定植宿主胃部能力的毒力因子，利于氧化應(yīng)激條件下幽門螺桿菌的生長和存活[4]。在本研究中，我們通過對幽門螺桿菌SodB血清抗體水平和是否患胃癌之間的關(guān)系進行分析，來評價SodB作為胃癌血清學篩查的生物標志物的價值。

1　材料與方法

1.1研究對象2010年3～7月間從黑龍江省腫瘤醫(yī)院住院處獲得經(jīng)臨床診斷確診的胃癌病例114例。對照包括2011年3～5月間來自哈爾濱市香坊區(qū)疾病預防控制中心的54例健康體檢人群以及來自哈爾濱醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的50例非胃癌患者。所有研究對象經(jīng)知情同意后采集外周靜脈血5 ml。

對研究對象采用問卷進行調(diào)查，調(diào)查問卷內(nèi)容包括：一般人口學指標、疾病相關(guān)的主要暴露因素、胃癌患者的臨床相關(guān)資料。

1.2試劑和儀器Broadford蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物公司。山羊血清封閉液購自武漢Boster生物公司。辣根酶標記山羊抗人IgG購自北京中杉金橋生物公司。TMB購自北京天根生化公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。重組質(zhì)粒sodB- pET32a及其誘導表達的目的蛋白為本實驗室制作并保存。

1.3方法將SodB純化蛋白濃度稀釋至2，0.5，0.25 μg/ml，每孔100 μl加至96孔板，4℃過夜。洗板3次，每次3 min，每孔加入200 μl封閉液(1 mg/dl BSA)，37℃水浴2 h。用血清稀釋液(0.1 ml/dl BSA+PBS)將目標血清按照400，1 600，3 200，3 600倍稀釋，空白孔為0.1 ml/dl BSA和PBS，每孔100 μl，37℃水浴1 h。每孔加入100 μl用PBS稀釋的辣根酶標記羊抗人IgG(1∶5 000稀釋)，37℃水浴30 min。每孔加入100 μl顯色液(TMB)，37℃避光水浴15 min。加入等體積1 mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)，450 nm下讀取吸光度A值。

1.4統(tǒng)計學分析采用t檢驗和χ2檢驗來比較病例組和對照組之間的定量變量和定性變量分布差異情況。SodB抗體的A值≤最佳臨界值則被定義為陽性，反之則定義為陰性。應(yīng)用條件logistic回歸方法計算比值比(ORs)及其95%置信區(qū)間(95% CIs)來分析SodB抗體與胃癌之間的關(guān)系。通過計算ROC曲線下面積(area under the ROC curves， AUCs)來分析、評價SodB抗體在胃癌篩查中的價值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1研究對象的基本情況本研究采用病例對照研究的方法，通過年齡、性別進行1∶1配對，共納入胃癌病例和對照各114例。

病例組和對照組年齡分別為53.86±8.15歲和53.05±7.65歲，病例組與對照組間年齡分布均衡，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.771，P=0.441)。病例組和對照組各包括男性82人(71.9%)，女性32人(28.1%)。受教育程度和BMI體重指數(shù)在病例組及對照組間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.185，P=0.027；χ2=16.121，P=0.003)。病例組和對照組吸煙人數(shù)分別為66人(57.89%)和54人(47.37%)，經(jīng)檢驗兩組吸煙情況存在統(tǒng)計學差異(χ2=9.376，P=0.009)。兩組飲酒情況差異也具有統(tǒng)計學意義(χ2=9.783，P=0.008)。病例組中具有胃癌家族史人數(shù)為11人(9.65%)，而對照組中均無胃癌家族史，經(jīng)檢驗兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=23.892，P<0.001)。另外，兩組間H.pylori感染情況差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.559，P=0.459)。綜上，受教育程度、BMI體重指數(shù)、吸煙情況、飲酒情況及胃癌家族史應(yīng)作為多因素分析時的調(diào)整因素。

根據(jù)收集的臨床資料按照TNM分期標準對胃癌患者進行臨床分期，其中7.84%(8/102)為Ⅰ期，10.78%(11/102)為Ⅱ期，73.53%(75/102)為Ⅲ期，7.84%(8/102)為Ⅳ期，缺失數(shù)據(jù)為12例。

2.2人血清SodB抗體與胃癌發(fā)病風險的關(guān)系見表1。在本研究人群中，選取SodB抗體A值0.028(最佳臨界值)作為篩查胃癌的臨界值，發(fā)現(xiàn)在病例和對照中H.pyloriSodB抗體陽性率分別為52.6%和36.8%。logistic回歸結(jié)果顯示，SodB抗體與胃癌發(fā)病風險關(guān)聯(lián)的A值(95%CI)為2.287(1.191～4.391)。

表1人血清SodB抗體水平與胃癌發(fā)病風險之間的關(guān)系[n(%)]

SodB感染情況病例數(shù)對照數(shù)OR(95%CI)?P陰性陽性54(474)60(526)72(632)42(368)102287(1191～4391)0013

注：*通過調(diào)整年齡、性別、BMI體重指數(shù)、教育、吸煙、飲酒、腫瘤家族史后，應(yīng)用多因素logistic回歸分析獲得。

2.3人血清SodB抗體ROC曲線下面積見圖1。

圖1　SodB抗體滴度測定ROC曲線

3　討論

幽門螺桿菌是已經(jīng)被證實的上消化道疾病最重要的危險因素之一。流行病學調(diào)查顯示其感染可使胃癌發(fā)生風險大幅度增加。研究顯示，根除H.pylori可使胃癌發(fā)病風險減少。但因世界范圍內(nèi)有數(shù)目龐大的感染人群，使得根除全部感染人群體內(nèi)的H.pylori無法實現(xiàn)。因此，迫切需要尋找用于篩查胃癌的可靠生物標志物。

大多數(shù)H.pylori感染者并無臨床表現(xiàn)，癌癥發(fā)生并確診時往往已經(jīng)到達癌癥的中晚期，因此預防胃癌發(fā)生及改善其預后需要提早發(fā)現(xiàn)和診斷的時間。研究顯示只有少數(shù)H.pylori感染者罹患胃癌[5]，說明個體對H.pylori毒力的免疫能力是不同的。目前研究多集中于H.pylori的幾個明星毒力因子，如CagA(細胞毒素相關(guān)基因蛋白)和VacA(空泡毒素)，對其他潛在毒力因子的研究較少。在本研究中，使用H.pylori毒力因子SodB作為免疫抗原，利用病例對照研究的方法研究其血清抗體與胃癌發(fā)生的關(guān)系，探討H.pyloriSodB能否作為有效的新胃癌篩查生物標志物。

本實驗室使用SodB蛋白作為免疫抗原進行酶聯(lián)免疫吸附測定，結(jié)果顯示，在本研究人群，血清SodB抗體陽性可使胃癌發(fā)生風險顯著升高，但二者間并不存在劑量反應(yīng)關(guān)系(數(shù)據(jù)未列出)。使用ROC曲線驗證SodB能否作為胃癌篩查的標志物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在本研究人群中，AUC為0.575(95%CI：0.501～0.649)。一般來說，AUC在0.5～0.7被認為是準確度較低，0.7 ～ 0.9為較好，高于0.9為高準確度[6]。說明雖然SodB抗體陽性率與胃癌發(fā)生有關(guān)，但獨立作為胃癌血清學篩查生物標志物的價值不高。近年有學者開始研究胃癌相關(guān)血清生物標志物的聯(lián)合檢測的作用，有學者發(fā)現(xiàn)了PGI，PGI/PGII，TSGF，TK1和CEA的聯(lián)合檢測分析可能更有助于對胃癌的診斷[7]。所以在接下來的研究中，可以考慮與其他血清生物標志物聯(lián)合，以提高診斷水平。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)H.pyloriSodB血清抗體水平與胃癌發(fā)生有關(guān)，但其不宜獨立作為胃癌血清學篩查的生物標志物。

參考文獻：

[1]Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al．Global cancer statistics，2012[J]．CA：A Cancer J Clin，2015，65(2)：87- 108．

[2]左婷婷，鄭榮壽，曾紅梅，等．中國胃癌流行病學現(xiàn)狀[J]．中國腫瘤臨床，2017，44(1)：52- 58．

Zuo TT，Zheng RS，Zeng HM，et al．Epidemiology of stomach cancer in China[J]．Chinese Journal of Clinical Oncology，2017，44(1)： 52- 58．

[3]Chen WQ，Zheng RS，Zhang SW，et al．Cancer incidence and mortality in China in 2013： an analysis based on urbanization level[J]．Chin J Cancer Res，2017，29(1)：1- 10．

[4]Tsugawa H，Mori H，Matsuzaki J，et al．Nordihyd- roguaiaretic acid disrupts the antioxidant ability ofHelicobacterpylorithrough the repression of SodB activity in vitro[J]．Biomed Res Int，2015，2015(12)：734548．

[5]Conteduca V，Sansonno D，Lauletta G，et al．Helicobacterpyloriinfection and gastric cancer：state of the art (review)[J]．Int J Oncol，2013，42(1)：5- 18．

[6]Zheng J，Ding X，Tian X，et al．Assessment of different biomarkers provides valuable diagnostic standards in the evaluation of the risk of acute rejection[J]．Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai)，2012，44(9)：730- 736．

[7]黃道桂，任傳路，虞紅艷，等．血清PGI，PGII，TK1，TSGF，CEA與CA724聯(lián)合檢測在胃癌診斷中的應(yīng)用價值[J]．現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志，2015，30(1)：101- 104．

Huang DG，Ren CL，Yu HY，et al．Application value of combined detection of PGI，PGII，TK1，TSGF，CEA and CA724 in diagnostic gastric cancer[J]．J Mod Lab Med，2015，30(1)：101- 104．