王飄飄,王會會,彭代銀,3,張善堂,陳衛(wèi)東,3
(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,安徽 合肥 230011;2. 安徽省立醫(yī)院藥劑科,安徽 合肥 230001;3.安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230031)
外泌體(exosomes,EXOs)是由大多數(shù)細(xì)胞分泌的納米級(30-150 nm)囊泡,如上皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等均可分泌EXOs[1]??梢愿鶕?jù)粒徑大小、囊泡攜帶的內(nèi)容物及其在體內(nèi)的去向來區(qū)別EXOs和其他囊泡[2]。因?yàn)槠渌哪遗?,比如微囊泡的形成方式是?xì)胞表面出芽,而EXOs通常被認(rèn)為起源于細(xì)胞內(nèi)的多泡小體,然后多泡小體和細(xì)胞質(zhì)膜融合而釋放EXOs[3]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包括凋亡小體、微囊泡(microvesicles,MVs)和EXOs在內(nèi)的細(xì)胞外囊泡,并已成為正常生理和病理狀況下細(xì)胞間通訊的重要參與者[4]。而EXOs攜帶的蛋白質(zhì)、核酸則是細(xì)胞間信號傳導(dǎo)和信息交流的載體[5]。巨噬細(xì)胞(macrophage,MΦ)是抗原呈遞細(xì)胞家族中一種重要的免疫細(xì)胞,可遞呈抗原到自身表面的MHC分子,抗原-MHC復(fù)合物通過和T細(xì)胞受體(T cell reporter,TCR)相互作用,引起T細(xì)胞的活化。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),來源MΦ的EXOs表面同樣表達(dá)MHCs及相應(yīng)的復(fù)合物,活化T細(xì)胞而獲得免疫反應(yīng)[6]。
EXOs因其獨(dú)特的生理作用而引起研究者的廣泛關(guān)注。然而,囊泡亞群并沒有完全明確的定義,并且有些囊泡在大小和密度上可能重疊,這使得一般的方法難以將其提取分離出來[7]。而且,EXOs所攜帶的物質(zhì)及其機(jī)制仍然存在很大的爭議[3],想得到完全純的囊泡幾乎不可能。另外,EXOs的提取和純化需要大量的物力和財(cái)力,特別是研究EXOs蛋白質(zhì)組學(xué)的實(shí)驗(yàn)。最近出現(xiàn)了使用方便、價(jià)格昂貴的商品化試劑盒,如產(chǎn)自Systems Biosciences的ExoQuickTM和產(chǎn)自Life Technologies 的Toal Exosome IsolationTM,盡管目前這些試劑盒被廣泛使用,但是研究者發(fā)現(xiàn)該試劑盒提取得到的EXOs的產(chǎn)量和質(zhì)量卻不及其他方法。
ExoQuick和Toal Exosome Isolation的主要成分是一些聚合物(如聚乙二醇或者乙烯類聚合物)。簡單的溶解聚乙二醇(PEG)來提取分離病毒和其他生物大分子已有50多年歷史[8]。因?yàn)镋XOs和病毒有著類似的生物學(xué)和物理學(xué)性質(zhì),假設(shè)用PEG沉淀的方法先將EXOs沉淀出來,再結(jié)合超高速離心除去雜質(zhì)蛋白,從而找到可以替代超高速離心和試劑盒的一種便宜可行的EXOs分離方法?;贏lbertsson等[8]使用的PEG濃縮病毒的方法來提取分離EXOs,為了驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性,將PEG沉淀結(jié)合超高速離心收集的EXOs和其他方法得到的EXOs進(jìn)行對比。通過檢測EXOs的形態(tài)、粒徑及蛋白表達(dá)情況,改進(jìn)方法的可行性。
1.1細(xì)胞小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7由復(fù)旦大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室提供。
1.2試劑RPMI 1640培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素購自Hyclone;胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自Gibco;BCA蛋白試劑盒購自碧云天公司;超敏感發(fā)光試劑盒購于Thermo公司;兔單克隆抗體Alix、TSG101、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG,均購自英國Abcam公司;PEG6000、氯化鈉均購自Sigma公司。
1.3儀器Tecnai G2 SpirtBiotwin生物性透射電鏡(美國賽默飛世爾公司);L-90K超高速低溫離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特公司);納米粒度儀NanoSight ZEN3690(英國馬爾文公司)。
Fig 1 The transmission electron microscopy of exosomes isolated from culture medium by ultra-high speed centrifugation (A), EXO Quick kit (B), polyethylene glycol 6000 precipitation(C)
2.1巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)用含有10% FBS(無EXOs)、1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞,待細(xì)胞融合到85%左右時(shí),收集細(xì)胞上清,將細(xì)胞正常傳代。
2.2細(xì)胞EXOs的提取
2.2.1超高速離心法將收集到的細(xì)胞上清液約200 mL,分裝在離心管中,4℃ 2 000×g離心10 min,10 000×g離心30 min除去細(xì)胞碎片,上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中,于120 000×g離心70 min(4℃),收集試管底部液體,加入PBS重懸,然后再4℃、120 000×g離心70 min,得到的沉淀就是EXOs(D-EXOs)。將沉淀用PBS重懸,-80℃保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2.2.2ExoQuick試劑盒用購自美國System Biosciences(SBI)公司的EXOs提取試劑盒,具體步驟按照試劑盒說明書。將收集到的細(xì)胞上清液4℃、2 000×g離心10 min,10 000×g離心30 min除去細(xì)胞碎片,然后將上清與試劑盒按照體積比5 ∶1混合,4℃靜置過夜,15 000×g離心30 min(4℃),將得到的沉淀(S-EXOs)用PBS重懸,-80℃保存。
2.2.3PEG6000改進(jìn)的PEG6000沉淀結(jié)合超高速離心法富集EXOs的具體步驟如下:將16 g PEG6000、5.18 g NaCl溶于100 mL超純水,配制成16%的儲備液。過0.45 μm濾膜后備用。將收集到的細(xì)胞上清液約200 mL,4℃、2 000×g離心10 min,10 000×g離心30 min除去細(xì)胞碎片,上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中,收集的上清液與等體積的PEG6000儲備液混合,上下顛倒混勻,于4℃冰箱靜置過夜(12 h以上);10 000×g離心60 min(4℃);棄去上清,沉淀用PBS重懸,120 000×g離心90 min(4℃),收集的沉淀即為EXOs(P-EXOs),用PBS重懸后,于-80℃冰箱保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2.3生物型透射電子顯微鏡(TEM)觀察EXOs的形態(tài)分別取超高速離心法、PEG6000沉淀法和試劑盒法提取的EXOs 20 μL,將EXOs滴加至銅網(wǎng)上,1 min后用濾紙吸干,再加1滴1%醋酸氧鈾1 min后,用濾紙吸干,置于白熾燈下烤干,于電子透射顯微鏡下觀察,并拍照。
2.4動態(tài)光散射(dynamiclightscattering,DLS)測定EXOs的粒徑取0.5 mL EXOs母液,4.5 mL超純水稀釋,過0.22 μm的濾膜后,用納米粒度儀對其粒徑進(jìn)行檢測。
2.5納米粒子示蹤技術(shù)(nanoparticletraceranalysis,NTA)測定EXOs的粒徑分布和濃度該技術(shù)可以實(shí)時(shí)直接通過光學(xué)顯微鏡收集觀測納米顆粒的散射光信號,然后對其在溶液中的布朗運(yùn)動進(jìn)行拍攝,最后對每個(gè)布朗運(yùn)動的粒子進(jìn)行追蹤及分析,快速準(zhǔn)確地計(jì)算出納米顆粒的流體力學(xué)半徑及濃度[9]。取EXOs母液,用水按照1 ∶7 500比例稀釋到10 mL,設(shè)置儀器參數(shù)進(jìn)樣,計(jì)算出細(xì)胞上清液中EXOs的濃度。
2.6Westernblot分析EXOs的特異性蛋白將分離純化的EXOs加上樣緩沖液,100℃煮沸5 min,冷卻至室溫,12% SDS-PAGE進(jìn)行蛋白分離,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉37℃封閉1.5 h,分別加入兔抗鼠TSG101單克隆抗體(1 ∶1 000)、兔抗鼠Alix單克隆抗體(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜,TBST洗膜10 min×3次,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG,室溫反應(yīng)2 h,TBST洗膜10 min×3次,ECL超敏發(fā)光試劑盒檢測。
3.13種方法得到的EXOs的形態(tài)透射電鏡下觀察3種方法得到的EXOs,F(xiàn)ig 1結(jié)果表明,3種方法提取分離得到的EXOs的粒徑大小均在100 nm左右,符合文獻(xiàn)報(bào)道的30~150 nm。染色后可以看到EXOs包膜完整,呈典型的杯狀結(jié)構(gòu)。
3.2EXOs的粒徑分布Fig 2 中1號曲線是差速離心法得到的EXOs,其平均粒徑為82.01 nm(PDI=0.592),2號曲線是ExoQuick試劑盒法得到的EXOs,粒徑的平均值為130.9 nm(PDI=0.847),3號曲線是PEG6000沉淀結(jié)合超高速離心法得到的EXOs,粒徑均值為78.4 nm(PDI=0.224)。從粒徑分析,PEG6000沉淀結(jié)合超高速離心得到的EXOs的平均粒徑最小,Exo Quick試劑盒法得到的EXOs的粒徑最大,但是差速離心法得到的EXOs粒徑集中分散在82 nm附近,另外兩種方法得到的EXOs粒徑范圍較大,但均在文獻(xiàn)報(bào)道的范圍內(nèi)。結(jié)果提示,采用PEG沉淀結(jié)合超高速離心法得到的EXOs含有較少的其他大囊泡和雜質(zhì)蛋白。
Fig 2 The particle size distribution of exosomes isolated byultra-high speed centrifugation (A), EXO Quick kit (B), polyethylene glycol 6000 precipitation (C)
3.3外泌體的濃度和粒徑分布將3種方法提取的EXOs經(jīng)PBS稀釋7 500倍,測得差速離心法得到的EXOs的濃度大約為5.6×1014·L-1,試劑盒提取得到的EXOs的濃度大約為8.2×1015·L-1,PEG沉淀結(jié)合超高速離心的EXOs濃度約為8.6×1015·L-1(Fig 3)。
Fig 3 Concentration of exosomes isolated by Ultra-high speed centrifugation (A), EXO Quick kit (B), polyethylene glycol 6000 precipitation(C)
3.4蛋白檢測結(jié)果蛋白印跡結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了3種方法均提取得到了EXOs(Fig 4),Alix和TSG101在MΦ及其EXOs中均有表達(dá),但是在EXOs中的表達(dá)豐度高于MΦ。
Fig 4 Expression of exosome surface marker of Alix and TSG101 isolated by ultra-high speed centrifugation, EXO Quick kit, polyethylene glycol 6000 precipitation
EXOs是內(nèi)源性的囊泡,可用于診斷和治療腫瘤等相關(guān)疾病[10]。MΦ是抗原呈遞家族細(xì)胞之一,其在腫瘤和炎癥的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色。M1型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的EXOs可以通過創(chuàng)建淋巴結(jié)的炎性環(huán)境,來增強(qiáng)抗腫瘤疫苗的活性[11],在缺氧環(huán)境下,巨噬細(xì)胞來源的EXOs誘發(fā)內(nèi)皮炎癥因子的表達(dá)[12]。在心臟損傷過程中,巨噬細(xì)胞來源的EXOs攜帶mir-155,抑制纖維細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其炎癥的產(chǎn)生[13]。正常巨噬細(xì)胞來源的EXOs攜帶較高水平的IL-6和IL-8,進(jìn)入胎盤后,影響胎盤對炎癥刺激的免疫調(diào)節(jié)能力[14]。越來越多研究發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞來源EXOs在腫瘤和炎癥反應(yīng)中的重要作用,為進(jìn)一步探討巨噬細(xì)胞EXOs的其他生理功能,建立一種高效分離細(xì)胞EXOs的方法變得尤為重要。
現(xiàn)在EXOs分離提取常用的方法有經(jīng)典的超高速離心法、試劑盒法、免疫磁珠法、親和層析法、PEG沉淀法等。超高速離心法需要較長時(shí)間,試劑盒價(jià)格昂貴,各方法都有其優(yōu)缺點(diǎn),而EXOs質(zhì)量和產(chǎn)量是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。Rider等[15]2016年發(fā)表的文章中對比了5%~10%及12%的7種PEG6000濃度提取細(xì)胞上清EXOs的總蛋白及RNA的數(shù)量和質(zhì)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),8%的PEG6000得到的EXOs的純度和傳統(tǒng)的差速離心法相近,后續(xù)共聚焦實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)PEG6000沉淀得到的EXOs的生物學(xué)功能不會受到影響,但是單純的PEG6000沉淀下來的會有很多雜質(zhì)蛋白,PEG也會部分黏附在EXOs表面,得到的EXOs不純且粒徑較大。
8% PEG6000沉淀結(jié)合超高速離心富集細(xì)胞上清中的EXOs,為了得到純度更高的EXOs,將得到的沉淀用PBS重懸,超高速離心100 000×g離心90 min,通過TEM、DLS及NTA對提取物的形態(tài)和大小分布情況進(jìn)行檢測。TEM結(jié)果顯示,PEG6000結(jié)合超高速離心法和差速離心法得到的EXOs在溶液中分散性較好,沒有大量的聚集,而試劑盒法得到的EXOs則有明顯的聚集,但是3種方法均得到了杯狀或不規(guī)則形狀的納米級囊泡,直徑符合文獻(xiàn)報(bào)道的30~150 nm之間。DLS的結(jié)果顯示,PEG6000沉淀結(jié)合超高速離心的EXOs的粒徑較小,但是DLS沒有NTA較高的分辨率,也無法計(jì)算粒子的濃度,所以我們用NTA對EXOs進(jìn)行進(jìn)一步的表征。NTA結(jié)果顯示,3種方法得到的EXOs的粒徑在100 nm左右,含有部分尺寸較大的囊泡,較大尺寸的囊泡可能由于EXOs的聚集所致,這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果也是相符的。PEG6000沉淀結(jié)合超高速離心法和試劑盒得到的EXOs的濃度相當(dāng),差速離心法的濃度略小一些。結(jié)合EXOs的表面穩(wěn)定表達(dá)的抗原呈遞蛋白,檢測了提取物中Alix和Tsg101表達(dá)情況,結(jié)果顯示,提取物均陽性表達(dá)這2種蛋白,結(jié)果可以再次證明PEG6000沉淀結(jié)合超高速離心提取細(xì)胞來源的EXOs的可靠性。
綜上,改進(jìn)的8% PEG6000沉淀結(jié)合超高速離心的方法可以準(zhǔn)確、快速、高效地提取分離出細(xì)胞上清中的EXOs,為后續(xù)研究探討MΦ來源的EXOs在腫瘤和炎癥方面的生物學(xué)功能及相關(guān)機(jī)制奠定了基礎(chǔ),為MΦ來源的EXOs在臨床醫(yī)學(xué)等方面的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
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