腺苷對(duì)肝癌細(xì)胞自噬和增殖的作用

蒲澤錦, 周小濤, 李國(guó)平, 詹浩煉, 郭益添, 項(xiàng)夢(mèng)琦, 劉麗璇, 譚　輝, 吳靈飛

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 1.消化內(nèi)科、2.放射科,廣東 汕頭　515041)

肝癌為世界范圍內(nèi)發(fā)病率居男性第6位、女性第7位的常見(jiàn)腫瘤，在所有癌癥相關(guān)性死亡中占第3位，在東亞和東南亞發(fā)病率高，在高收入的國(guó)家發(fā)病率偏低，我國(guó)肝癌發(fā)病和死亡病例數(shù)約占全世界一半左右[1-2]。單一、早期小肝癌可手術(shù)切除，不幸的是絕大多數(shù)肝癌發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)為巨大的晚期肝癌，多有侵襲轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，預(yù)后很差。化療在目前仍是一種常用的肝癌治療方法，但化療藥實(shí)際使用效果并不理想，病人的生存期短。在影響化療藥物的因素中，自噬的作用受到廣泛的關(guān)注。

自噬是依賴溶酶體水解細(xì)胞內(nèi)有害物質(zhì)的過(guò)程，包括微自噬、巨自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。通過(guò)溶酶體膜或其他細(xì)胞器膜包裹需要降解的底物，或分子伴侶與底物結(jié)合后，再與溶酶體結(jié)合，最后在溶酶體內(nèi)將底物降解。降解后產(chǎn)生氨基酸、游離脂肪酸等物質(zhì)，有利于細(xì)胞過(guò)度缺氧或饑餓引起的不利環(huán)境[3]。自噬改變了肝癌細(xì)胞的生存能力，影響了肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的反應(yīng)敏感性[4-6]。

腺苷是一種嘌呤核苷，與相應(yīng)的4種腺苷受體A1、A2A、A2B、A3結(jié)合而發(fā)揮作用。腺苷在細(xì)胞外以低濃度持續(xù)存在，在炎癥或癌癥等代謝應(yīng)激下濃度明顯增加，通過(guò)減少組織能量消耗，清除細(xì)胞內(nèi)有害物質(zhì)，腺苷施加了保護(hù)性效果。有研究顯示，在實(shí)體腫瘤細(xì)胞外液中腺苷濃度增加10～20倍，腺苷可調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞，抑制炎癥因子如白介素-12的釋放，有利于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[7]。腺苷誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，也可通過(guò)降低甲基化激活p53和線粒體相關(guān)凋亡通路，引起肝癌細(xì)胞凋亡[9]，但腺苷是否引起肝癌細(xì)胞內(nèi)自噬水平變化目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1細(xì)胞HepG2細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2試劑DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；腺苷、單丹(磺)酰戊二胺(monodansylcadaverine, MDC)、DMSO、LC3B兔多抗購(gòu)自Sigma公司；β-tubulin鼠單抗購(gòu)自Abcam公司；山羊抗兔IgG(H+L)、山羊抗小鼠IgG(H+L)購(gòu)自Jackson公司；預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自Thermo公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海生工；ECL化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Millipore公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。

1.1.3儀器生物倒置光學(xué)顯微鏡、生物正置熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo公司；電泳儀、垂直電泳槽、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜槽購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸后，轉(zhuǎn)至細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，吹打混勻細(xì)胞；培養(yǎng)皿放于二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，次日進(jìn)行換液。每1～2 d換1次培養(yǎng)基，細(xì)胞鋪滿95%培養(yǎng)皿時(shí)用質(zhì)量濃度為0.25 g·L-1的胰蛋白酶消化傳代。

1.3CCK-8檢測(cè)腺苷對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響按2×103個(gè)/孔將對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于96孔板。待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，分別加入含不同濃度腺苷(0、1.0、2.0、3.0、4.0 mmol·L-1)的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，使用CCK-8檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，選擇觀察時(shí)間點(diǎn)分別為0、12、24、48 h。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4Westernblot檢測(cè)LC3表達(dá)按5×105個(gè)/孔將對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于6孔板。待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，分別加入含有不同濃度腺苷(0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol·L-1)的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞；或者加入1 mmol·L-1腺苷后，于0、6、12、24 h收集細(xì)胞。裂解細(xì)胞，4℃、13 000 r·min-1離心30 min，吸取上清液，測(cè)定總蛋白濃度，水浴煮沸變性5 min。配制12%分離膠和5%濃縮膠，按每孔10 μg總蛋白量進(jìn)行上樣，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，TBST室溫封閉30 min。加入LC3B兔多抗和β-tubulin鼠單抗，4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜5次，添加二抗，37℃室溫?fù)u晃孵育40 min，TBST洗膜5次，ECL發(fā)光液處理后膠片曝光、顯影、定影。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5MDC染色觀察自噬體形成待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期，胰酶消化收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將免洗爬片置于24孔培養(yǎng)板中，按5×104個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)量接種于24孔板。加入腺苷(1.0 mmol·L-1)后，于0、6、12、24 h加入MDC染色液，37℃避光孵育30 min。PBS漂洗2次，取載玻片并滴加少量抗熒光猝滅劑，熒光顯微鏡觀察拍照。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2　結(jié)果

2.1不同濃度腺苷作用不同時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響腺苷(1.0～4.0 mmol·L-1)作用于HepG2細(xì)胞，在0～48 h進(jìn)行檢測(cè)。如Tab 1所示，腺苷處理組與未添加腺苷組相比較，細(xì)胞增殖均受到明顯抑制(P<0.01)；腺苷(2.0、3.0、4.0 mmol·L-1)抑制細(xì)胞增殖組間差異無(wú)顯著性，1.0 mmol·L-1與2.0～4.0 mmol·L-1腺苷在作用于細(xì)胞48 h后，抑制細(xì)胞增殖有明顯差異(P<0.01)。

2.2不同濃度腺苷對(duì)HepG2細(xì)胞自噬的影響如Fig 1所示，腺苷處理HepG2細(xì)胞24 h，與未加腺苷組相比，腺苷(0.2、0.5、1.0 mmol·L-1)均引起細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低，1.0 mmol·L-1濃度的腺苷引起細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值最低(P<0.01)，4.0 mmol·L-1腺苷引起HepG2細(xì)胞內(nèi)自噬增強(qiáng)(P<0.05)。

2.3腺苷作用于HepG2細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)自噬的變化1.0 mmol·L-1濃度的腺苷作用于HepG2

Fig 1　Effect of adenosine on autophagy in HepG2 cells (±s, n=3)

A: Western blot showed LC3-Ⅱ and LC3-Ⅰ expression in HepG2 cells incubated with adenosine (0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 mmol·L-1) for 24 h; B: Quantitative analysis of the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ.*P<0.05,**P<0.01vs0 mmol·L-1group.

Tab 1　Effect of adenosine on viability of HepG2 cells in 48-hour period(±s, n=3)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vs1 mmol·L-1adenosine

細(xì)胞后，在0～24 h細(xì)胞自噬的變化結(jié)果見(jiàn)Fig 2所示，腺苷引起細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低，在12 h最低(P<0.01)。

Fig 2　Effect of adenosine (1.0 mmol·L-1) on autophagy in HepG2 cells in 24-hour period(±s, n=3)

A: Western blot assay showed LC3-Ⅱ and LC3-Ⅰ expression in HepG2 cells; B: Quantitative analysis of the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ.*P<0.05,**P<0.01vs0 h group.

2.4腺苷對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)自噬體形成的影響1.0 mmol·L-1濃度的腺苷作用于HepG2細(xì)胞，在0、6、12、24 h MDC染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬體。Fig 3結(jié)果顯示，腺苷作用使自噬體減少，在12 h細(xì)胞內(nèi)自噬體基本消失，24 h可出現(xiàn)極少量自噬體。

Fig 3　Autophagosomes reduced by adenosine (1.0 mmol·L-1) in HepG2 cells showed by MDC

A: Autophagosomes at 0 h; B: Autophagosomes at 6 h; C: Autophagosomes at 12 h; D: Autophagosomes at 24 h. In 24 h period, minimal autophagosomes were observed at 12 h detecting point.

3　討論

自噬是細(xì)胞內(nèi)溶酶體參與分解未折疊蛋白或處理變異蛋白的一個(gè)過(guò)程，形態(tài)學(xué)上以形成自噬體為特征，近年來(lái)關(guān)于多種組織中自噬的研究快速發(fā)展。評(píng)估自噬反應(yīng)，主要通過(guò)免疫印跡測(cè)定脂化的微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)和顯微鏡下觀察熒光自噬小體的方法。在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸缺乏的饑餓環(huán)境等應(yīng)激條件下，存在于細(xì)胞質(zhì)中的LC3-Ⅰ蛋白被清除，脂化成LC3-Ⅱ，嵌入吞噬泡膜中，因此，小分子LC3-Ⅱ蛋白增多和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增大是自噬增加的明顯標(biāo)志[3]。自噬體為雙層或多層膜包被的圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)，內(nèi)含細(xì)胞質(zhì)、變異蛋白質(zhì)、損傷的細(xì)胞器等，可被嗜酸性染色劑MDC染色，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)核周區(qū)域和其他部位細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性顯色。

腺苷在體內(nèi)可發(fā)揮抗腫瘤作用的環(huán)節(jié)較多，可通過(guò)與腺苷受體結(jié)合直接誘導(dǎo)腫瘤凋亡[10]，也可通過(guò)轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和其他磷酸化腺苷等途徑，影響腫瘤細(xì)胞凋亡或轉(zhuǎn)移[11]。既往課題組研究發(fā)現(xiàn)，腺苷通過(guò)去甲基化方式和影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[8-9]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腺苷抑制細(xì)胞增殖活力，增大腺苷濃度，肝癌細(xì)胞的增殖被抑制程度并非同等地增強(qiáng)，1.0 mmol·L-1濃度的腺苷能有效抑制肝癌細(xì)胞增殖，但實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)時(shí)間延長(zhǎng)到48 h，增大腺苷濃度(2～4 mmol·L-1)能更有效地抑制肝癌細(xì)胞增殖。低濃度的腺苷(不超過(guò)1.0 mmol·L-1)抑制肝癌細(xì)胞內(nèi)自噬，加大腺苷濃度至4.0 mmol·L-1，細(xì)胞自噬活動(dòng)反而增強(qiáng)。低濃度腺苷在作用于肝癌細(xì)胞12 h后抑制自噬最為明顯，MDC染色也顯示此時(shí)自噬體明顯減少，其后自噬體再次增多，自噬功能有恢復(fù)跡象。這也反映出腺苷在體內(nèi)參與核苷酸代謝，腺苷可能被細(xì)胞利用合成腺嘌呤核苷酸，參與能量代謝或其他生理過(guò)程，腺苷被消耗，失去了自噬抑制功能。

自噬對(duì)腫瘤具有雙重作用機(jī)制，早期自噬通過(guò)對(duì)未折疊或變性蛋白的清除以清除腫瘤細(xì)胞，抑制自噬則有利于腫瘤生長(zhǎng)[12-13]。也有文獻(xiàn)顯示，抑制自噬可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，如增強(qiáng)自噬則減少腫瘤細(xì)胞凋亡，削弱抗癌藥物效果[14-15,5]。進(jìn)展期腫瘤組織中細(xì)胞快速增殖，血供相對(duì)缺乏，在缺氧和營(yíng)養(yǎng)不足的應(yīng)激條件下，自噬被大量活化，降解未折疊蛋白或變性蛋白，使得腫瘤細(xì)胞存活能力增強(qiáng)，凋亡減少。許多抗腫瘤藥物在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時(shí)，也引起腫瘤細(xì)胞自噬增加，聯(lián)合運(yùn)用自噬抑制劑可增強(qiáng)藥物治療效果[14,4]。腺苷誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示低濃度的腺苷在抑制腫瘤細(xì)胞增殖同時(shí)，還降低肝癌細(xì)胞內(nèi)自噬，可以設(shè)想當(dāng)與其他抗肝癌藥物聯(lián)用后，更有利于發(fā)揮協(xié)同抗癌效果。

總之，本研究提示抗腫瘤藥物腺苷不僅抑制肝癌細(xì)胞增殖，同時(shí)可影響肝癌細(xì)胞內(nèi)的自噬，低濃度腺苷可有效抑制自噬，增加腺苷的濃度并不伴隨著細(xì)胞自噬抑制加強(qiáng)，高濃度腺苷能誘導(dǎo)自噬增強(qiáng)。迄今的化療藥物對(duì)肝癌細(xì)胞并不敏感，腺苷不僅可以通過(guò)自身誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖而發(fā)揮抗腫瘤作用，而且可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)自噬反應(yīng)程度，增強(qiáng)其他抗肝癌藥物的治療效果，是一種有希望的肝癌化療藥物。

(致謝：本研究在汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室完成，在此致以由衷的感謝！)

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