鬼箭羽醇提物對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型的作用

萬(wàn)　星，郭　瓊，劉向東，黃德斌

(湖北民族學(xué)院1. 醫(yī)學(xué)院、2. 附屬民大醫(yī)院西藥科、3. 附屬民大醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 恩施　445000)

肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是肝臟對(duì)各種慢性刺激(如病毒感染、藥物誘導(dǎo)、自身免疫等)進(jìn)行損傷修復(fù)反應(yīng)時(shí)，以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)在肝內(nèi)大量沉積的病理過(guò)程，是所有慢性肝病共同的病理基礎(chǔ)，是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段[1-2]。目前，臨床并無(wú)特異性治療藥物，因此，了解HF的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找有效的預(yù)防或治療HF的藥物具有重大意義。鬼箭羽(Euonymusalatus，EA)為衛(wèi)矛科植物衛(wèi)矛的具翅狀物枝條或翅狀附屬物，具有破血通經(jīng)、解毒消腫之功效，主要化學(xué)成分有生物堿、黃酮類(lèi)、甾體、三萜等，具有降血糖、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗氧化作用[3-5]，其中，醇提物顯示出抗菌、抗炎、抗氧化作用[4-5]。HF依賴(lài)肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)的活化增殖,且Herrmann等[6]認(rèn)為，HSC的活化分3階段，前炎癥階段、炎癥階段和后炎癥階段。以炎癥為切入點(diǎn)，結(jié)合目前多數(shù)報(bào)道鬼箭羽醇提物為抗炎部位，我們初次探究了鬼箭羽醇提物對(duì)四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的作用及機(jī)制。

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6小鼠，♂，體質(zhì)量(17±3) g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK京2016-0011。

1.2藥品與試劑鬼箭羽中藥購(gòu)于湖北恩施宏升大藥房(產(chǎn)地：湖北)；CCl4(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，臨用前溶于橄欖油)；ALT、AST試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TNF-α ELISA試劑盒(美國(guó)BD公司)；鼠源α-SMA、CollagenⅠ一抗(英國(guó)Abcam公司)；β-actin一抗、山羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；BCA試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光劑(美國(guó)Thermo公司)；其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

2　方法

2.1鬼箭羽醇提物的制備稱(chēng)取一定量鬼箭羽中藥材，粉碎，采用10倍量60%的乙醇冷凝回流2次，每次2 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成浸膏狀后，冷凍干燥成粉末，室溫保存，臨用時(shí)溶于雙蒸水。

2.2動(dòng)物分組、造模及給藥為了初步確定藥靶在疾病發(fā)生的上游還是下游，并結(jié)合文獻(xiàn)將HSC的活化分3階段，初次實(shí)驗(yàn)時(shí)，將藥物組分為前期用藥組和后期用藥組，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5,7]和本次研究的預(yù)實(shí)驗(yàn)，每組設(shè)低、中、高3個(gè)劑量(L:2 g·kg-1，M:4 g·kg-1，H:8 g·kg-1)，80只動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分8組：正常組(normal)、CCl4模型組(model)、鬼箭羽醇提物低劑量前期組(EAE-L)、中劑量前期組(EAE-M)、高劑量前期組(EAE-H)、鬼箭羽醇提物低劑量后期組(EAL-L)、鬼箭羽醇提物中劑量后期組(EAL-M)、鬼箭羽醇提物高劑量后期組(EAL-H)。模型組小鼠腹腔注射含25% CCl4的橄欖油溶液1.6 mL·kg-1，每周2次，共30 d 9次；EAE組在造模同時(shí)，僅1～15 d連續(xù)灌胃藥物；EAL組在造模同時(shí)，僅16～30 d連續(xù)灌胃藥物；正常組全程灌胃等體積的生理鹽水。所有小鼠30 d后禁食不禁水，24 h后處死，按要求保留標(biāo)本。

2.3血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)小鼠眼球采血后，靜置分離血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，ELISA法測(cè)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。

2.4肝臟外觀形態(tài)觀察及肝指數(shù)測(cè)定小鼠稱(chēng)重，眼球采血后，頸椎脫臼處死，取肝臟，用高倍相機(jī)在同背景、同視野下，拍攝肝臟外觀。用生理鹽水沖洗肝臟，濾紙吸干，稱(chēng)肝臟重量，計(jì)算肝指數(shù)。肝指數(shù)/%=肝重(g)/體重(g)×100%。

2.5HE染色肝臟用10%甲醛固定24 h，HE染色時(shí)，石蠟切片于二甲苯脫蠟3次，過(guò)梯度乙醇各5 min，水洗1 min，蘇木精染色5 min，水洗1 min，1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗2 min，伊紅染2 s，入乙醇脫水2 min，二甲苯透明、封固、鏡檢。

2.6Masson染色常規(guī)脫水包埋，切片脫蠟至水，Harris蘇木精染色10 min，流水稍洗，1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗2 min，麗春紅酸性品紅染液染5 min，流水稍洗，磷鉬酸溶液5 min，苯胺藍(lán)復(fù)染5 min，1%冰醋酸處理1 min，95%乙醇多次脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。

2.7免疫組織化學(xué)檢測(cè)α-SMA、CollagenⅠ表達(dá)石蠟切片脫蠟至水，高溫高壓修復(fù)2 min，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)入TBS緩沖液沖洗3次，每次5 min，3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶室溫20 min，TBS沖洗3次，每次5 min，10%山羊血清孵育20 min，一抗(α-SMA 1 ∶150，CollagenⅠ 1 ∶600)4℃孵育過(guò)夜，次日復(fù)溫后，TBS沖洗3次，每次5 min；每張切片滴50 μL二抗，室溫孵育30 min，TBS沖洗3次，每次5 min，DAB顯色，流水沖洗，蘇木精復(fù)染2 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化2 s，溫水返藍(lán)，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，封片。

2.8Westernblot檢測(cè)α-SMA、CollagenⅠ蛋白表達(dá)稱(chēng)取肝臟組織100 mg,加1 mL RIPA裂解液勻漿破碎組織，再超聲破碎(超聲時(shí)間3 s，間隔10 s，超聲10次)，冰上裂解30 min后，4℃、12 000 r·min-1離心20 min,取上清，BCA法測(cè)蛋白濃度后，加5×上樣緩沖液，100 ℃變性5 min，-20 ℃保存。配制10%的分離膠，電泳，電轉(zhuǎn)移，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗(α-SMA 1 ∶3 000，CollagenⅠ 1 ∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，洗脫，孵二抗(1 ∶80 000)，90 min，洗脫，曝光。

3　結(jié)果

3.1EA對(duì)肝臟形態(tài)和肝指數(shù)的影響如Fig 1所示，正常組肝臟呈分布均勻紅褐色，包膜光滑；CCl4組表面彌漫明顯的大小不一的塌陷區(qū)，邊緣泛白；鬼箭羽醇提物組減少肝臟表面塌陷區(qū)的數(shù)量和程度，其中，前期給藥組形態(tài)改善較后期給藥組好。Tab 1結(jié)果顯示，模型組肝指數(shù)高于正常組(P<0.05)，EAE-M、EAE-L、EAL-L 3組較模型組肝指數(shù)降低(P<0.05)，同劑量的藥物，前期和后期給藥組間無(wú)差異。

Tab1　Effect of EA on liver index (±s, n=10)

*P<0.05vsnormal;#P<0.05vsmodel

3.2EA對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠血清ALT、AST的影響如Fig 2所示，與正常組相比，模型組ALT、AST活性明顯升高(P<0.01)，EA醇提物量效依賴(lài)地降低其表達(dá)，其中，EAE-L對(duì)ALT和AST的作用優(yōu)于EAL-L(P<0.05)，EAE-M和EAL-M，EAE-H和EAL-H比較，對(duì)ALT、AST影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.3EA對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠病理形態(tài)學(xué)的影響Fig 3的HE染色顯示，正常組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常；CCl4組肝小葉被破壞，肝細(xì)胞不同程度的水腫、結(jié)構(gòu)紊亂、明顯腫脹變形，有點(diǎn)狀、片狀壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；鬼箭羽醇提物前期給藥組較CCl4組，損傷量效依賴(lài)地減輕，肝索排列較整齊，肝小葉基本恢復(fù)正常，炎性因子減少，水腫無(wú)改變；鬼箭羽醇提物后期給藥組較CCl4組，肝小葉破壞和炎性因子浸潤(rùn)仍然存在，僅表現(xiàn)為破壞程度和數(shù)量減少。Masson染色顯示，正常組肝小葉結(jié)構(gòu)正常；CCl4組肝索紊亂，肝細(xì)胞水腫，大量膠原沉積，在匯管區(qū)之間、匯管區(qū)與中央靜脈之間形成纖維間隔，分離原來(lái)肝小葉，形成假小葉；鬼箭羽醇提物組仍見(jiàn)壞死以及膠原沉積，肝小葉被破壞，其損傷較CCl4組呈量效依賴(lài)地減輕，且低、中劑量鬼箭羽前期給藥組膠原沉積量降低程度明顯優(yōu)于后期給藥組。

Fig 1　Effect of EA on liver morphology

Fig 2　Effect of EA on activities of ALT, AST(±s, n=10)

Fig 3　Effect of EA on morphology by HE and Masson

3.4EA對(duì)小鼠肝組織α-SMA表達(dá)的影響α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)是HSC活化的標(biāo)志物。Fig 4的免疫組化結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組α-SMA升高，EA量效依賴(lài)地降低了其表達(dá)，同一劑量EAE效果優(yōu)于EAL。Fig 5的Western blot結(jié)果亦提示，模型組α-SMA增高(P<0.05)，EA醇提物能降低其表達(dá)(P<0.05)，且同劑量藥物(4 g·kg-1)在前期給藥降低效果明顯(P<0.05)。

3.5EA對(duì)小鼠肝組織CollagenⅠ表達(dá)的影響肝纖維化是以CollagenⅠ為主的肝臟細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積的結(jié)果。Fig 6的免疫組化顯示，與正常組比較，模型組CollagenⅠ明顯升高，EA組量效依賴(lài)地降低了其表達(dá)。Fig 7的Western blot結(jié)果亦提示，模型組CollagenⅠ增高(P<0.01)，EA醇提物能降低其表達(dá)(P<0.05)，且同劑量藥物(4 g·kg-1)在前期給藥降低效果明顯(P<0.05)。

Fig 4　Effect of EA on α-SMA expression by IHC

Fig 6　 Effect of EA on Collagen Ⅰ expression by IHC

Fig 5　Effect of EA on α-SMA expression by Western blot (±s, n=10)

**P<0.01vsnormal;#P<0.05vsmodel;△P<0.05vsEA ethanol extracts group of 4 g·kg-1of later stage

3.6EA對(duì)小鼠血清TNF-α水平的影響如Fig 8所示，模型組較正常組TNF-α明顯升高(P<0.01)，EA醇提物呈量效依賴(lài)性地降低其表達(dá)(P<0.05)，同劑量前期給藥和后期給藥組間無(wú)明顯差異(P>0.05)。

4　討論

鬼箭羽史載《神農(nóng)本草經(jīng)》，又名衛(wèi)矛、神箭、六月凌、八樹(shù)等，為傳統(tǒng)中藥，全世界有衛(wèi)矛屬植物220種，我國(guó)約有110種，廣泛分布于我國(guó)各地[8]。其味甘、澀，無(wú)毒，性微寒而堅(jiān)陰清熱，具有破血通經(jīng)、解毒消腫、殺蟲(chóng)之功效[3]。近年臨床用于治療糖尿病、高血脂癥、動(dòng)脈硬化、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎效果明顯，民間使用鬼箭羽治療糖尿病取得較好成果[9]，在韓國(guó)和日本多用于抗腫瘤[10]。鬼箭羽化學(xué)成分復(fù)雜，目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道有黃酮和黃酮苷、強(qiáng)心苷、五環(huán)三萜、甾體、有機(jī)酸等化合物[11]。據(jù)報(bào)道，鬼箭羽水提物可降血糖、降血脂[12]，咖啡酸抗腫瘤[13]，鬼箭羽醇提物具有抗菌、抗炎、抗氧化[4-5]等藥理功效。

Fig 7　Effect of EA on Collagen Ⅰ expression by

**P<0.01vsnormal;#P<0.05vsmodel;△P<0.05vsEA ethanol extracts group of 4 g·kg-1of later stage

Fig 8　Effect of EA on TNF-α level

**P<0.01vsnormal;#P<0.05vsmodel

CCl4是一種選擇性肝毒性物質(zhì)，在肝內(nèi)通過(guò)肝微粒體細(xì)胞色素酶P450氧化酶激活后，產(chǎn)生三氯甲基自由基，可引發(fā)活性氧自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，損傷肝細(xì)胞，導(dǎo)致狄氏間隙內(nèi)HSC活化，釋放Ⅳ型膠原酶降解Ⅳ型膠原，并合成大量Ⅰ型膠原取代Ⅳ型膠原，促使肝纖維化。HSC活化是纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，而臨床上無(wú)論病毒感染、藥物作用，還是自身免疫，最終都會(huì)經(jīng)過(guò)HSC活化發(fā)展成纖維化，若藥物對(duì)此經(jīng)典模型有作用，將有較大臨床意義。本實(shí)驗(yàn)中，鬼箭羽醇提物量效依賴(lài)降低肝指數(shù)，降低ALT、AST活性，減少致纖維化因子CollagenⅠ分泌和HSC活化標(biāo)志物[14]α-SMA的生成，顯示出良好的抗肝損傷和阻止纖維化的功能。

根據(jù)課題組前期報(bào)道，鬼箭羽醇提物有抗炎、抗菌功效[4-5]，本實(shí)驗(yàn)中HE染色的結(jié)果顯示，鬼箭羽醇提物減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，結(jié)合HSC激活可能與Kuffer細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞分泌的一些細(xì)胞因子，如TNF-α、TGF-β等有關(guān)[15]，實(shí)驗(yàn)初步選取了其中一個(gè)激活因子TNF-α進(jìn)行探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CCl4組較正常組TNF-α分泌增多，鬼箭羽醇提物明顯降低其表達(dá)，有趣的是，前期給藥和后期給藥作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此推測(cè)，TNF-α分泌貫穿發(fā)病全過(guò)程，鬼箭羽醇提物所含不同單體在纖維化發(fā)病信號(hào)通路上作用階段不同，且TNF-α介導(dǎo)的信號(hào)通路可能是一環(huán)路，導(dǎo)致不同單體在不同階段對(duì)TNF-α都有抑制作用，使得造模前期給藥和后期給藥作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

時(shí)效實(shí)驗(yàn)中，多數(shù)指標(biāo)顯示鬼箭羽醇提物前期給藥組抗纖維化的能力要明顯優(yōu)于后期組，一方面提示臨床越早發(fā)現(xiàn)，越早干預(yù)為佳；另一方面，課題組推測(cè)鬼箭羽醇提物抗纖維化的藥靶可能是纖維化發(fā)病機(jī)制的上游蛋白。確切的抗纖維化作用及眾多有趣的發(fā)現(xiàn)，使我們對(duì)鬼箭羽醇提物發(fā)揮藥效的具體成份、靶點(diǎn)及作用機(jī)制非常感興趣，并將在后期做進(jìn)一步研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心和附屬民大醫(yī)院風(fēng)濕免疫省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝支持。)

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