大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型的建立及軟骨組織中MMP-13和ADAMTS-5的表達(dá)

　，，，　，

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，安徽 合肥 230000)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種慢性、進(jìn)行性、退行性關(guān)節(jié)病變,是臨床上常見的關(guān)節(jié)疾病之一。該病的發(fā)病率與年齡和性別密切相關(guān)，病變主要累及全身的大關(guān)節(jié)，膝關(guān)節(jié)是其好發(fā)關(guān)節(jié)之一。OA的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明了，其病理變化主要是關(guān)節(jié)軟骨的丟失及軟骨下骨的硬化。OA中關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解、合成失衡，進(jìn)而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡最終引起軟骨丟失。構(gòu)成軟骨基質(zhì)的骨架部分是主要是Ⅱ型膠原蛋白和聚蛋白多糖。一直以來，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)家族被認(rèn)為是降解Ⅱ型膠原和聚蛋白多糖的經(jīng)典酶類，但近年來研究表明，帶有血小板凝血酶敏感蛋白結(jié)構(gòu)域的解聚素與金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif，ADAMTS)家族也在OA的發(fā)病中起著重要的作用。在軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程中，尤其是MMP-13和ADAMTAS-5發(fā)揮著重要作用[1]。本研究采用大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶離斷聯(lián)合內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)制作動(dòng)物OA模型，并使用Western blot技術(shù)和免疫組化方法檢測MMP-13和ADAMTAS-5蛋白在造模不同時(shí)期表達(dá)的變化，旨在用此模型對(duì)OA發(fā)病機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探討，以期能為臨床早期預(yù)防、治療OA提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器

SD雌性大鼠40只，體質(zhì)量(225±25)g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(合格證號(hào)：皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字第01號(hào))。實(shí)驗(yàn)于安徽醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心實(shí)施，大鼠自由進(jìn)食水，晝夜節(jié)律12 h∶12 h。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵循安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例執(zhí)行。抗MMP-13抗體、抗ADAMTS-5抗體(英國Abcam公司)；抗β-actin抗體(中國Biosharp公司)；辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠/兔二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；手術(shù)器械(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心手術(shù)室提供)；顯微鏡(日本奧林巴斯公司) 。

1.2　動(dòng)物模型的制作

用電腦產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)字，將大鼠隨機(jī)分為模型組30只和假手術(shù)組10只。大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉成功后，取仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，術(shù)區(qū)常規(guī)備皮、消毒、鋪巾。選取30只模型組大鼠行右膝內(nèi)側(cè)副韌帶離斷加內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)建立右膝OA模型。手術(shù)步驟：右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切口切開皮膚，直視下切斷并剪掉部分內(nèi)側(cè)副韌帶，進(jìn)入關(guān)節(jié)腔。將髕骨脫位推向外側(cè),膝關(guān)節(jié)屈曲位,切除內(nèi)側(cè)半月板。碘伏、生理鹽水沖洗切口,使用4-0縫線逐層關(guān)閉切口(圖1)。另10只行右膝關(guān)節(jié)切開術(shù)，不破壞關(guān)節(jié)內(nèi)部結(jié)構(gòu)，作為假手術(shù)組。術(shù)后2 h所有大鼠清醒，正常進(jìn)食水。術(shù)后每天每只大鼠肌肉注射青霉素20萬u預(yù)防感染，連續(xù)應(yīng)用3 d。

1.3　退變關(guān)節(jié)軟骨大體觀察

模型組大鼠分別于術(shù)后4、6、8周處死，每次處死10只。假手術(shù)組于術(shù)后8周處死。解剖術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié),觀察內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)關(guān)節(jié)面的病理改變,按照以下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分:關(guān)節(jié)面光整為0分；關(guān)節(jié)面粗糙為1分；關(guān)節(jié)面糜爛為2分；關(guān)節(jié)面潰瘍?yōu)?分；軟骨剝脫為4分[2]。

1.4　Western blot法檢測大鼠關(guān)節(jié)軟骨中MMP-13和ADAMTS-5蛋白的表達(dá)水平

取下大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨，剪碎研磨，用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法進(jìn)行總蛋白定量，100 ℃水浴10 min,使樣本蛋白變性，與蛋白上樣緩沖液混勻后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，取出PVDF膜用TBST溶液洗滌。體積分?jǐn)?shù)8%的脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗后置入4 ℃冰箱過夜，次日用TBST溶液洗膜。加入二抗室溫下孵育1.5 h，再次用TBST洗膜。ECL法顯色，顯影儀顯影。使用Image J測定灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，目的蛋白與β-actin的灰度比值作為其相對(duì)表達(dá)水平。

a:右膝術(shù)區(qū)消毒鋪巾；b：切斷內(nèi)側(cè)副韌帶、切開關(guān)節(jié)囊；c：切除內(nèi)側(cè)半月板；d：縫合關(guān)節(jié)囊；e：縫合皮膚

1.5　免疫組化檢測大鼠關(guān)節(jié)軟骨中MMP-13和ADAMTS-5蛋白的表達(dá)水平

大鼠膝關(guān)節(jié)標(biāo)本用4%多聚甲醛固定12 h，10%EDTA脫鈣12周后石蠟包埋，進(jìn)行常規(guī)組織石蠟切片，4 μm 組織切片脫蠟，二甲苯、梯度酒精水化，將切片放置在燒開的檸檬酸中，冷卻至室溫，取出切片。PBS沖洗，滴加MMP-13和ADAMTS-5兔抗鼠一抗試劑，4 ℃孵育過夜；PBS沖洗，滴加二抗，37 ℃溫箱孵育20 min； PBS沖洗，滴加DAB顯色，顯微鏡下適時(shí)終止，自來水沖洗5 min， 蘇木素復(fù)染1 min，37 ℃溫箱至干，加入封片劑封片。參照Pelletier等[3]的方法，顯微鏡下觀察，每個(gè)切片隨機(jī)取3個(gè)視野，每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，取觀察結(jié)果的平均值進(jìn)行計(jì)算。陽性細(xì)胞為軟骨細(xì)胞被染成棕褐或棕黃色，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞的百分率，陽性細(xì)胞率=(陽性細(xì)胞數(shù)/所計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.6　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1　大體觀察

假手術(shù)組脛骨平臺(tái)軟骨面平整光滑，關(guān)節(jié)軟骨無破壞，關(guān)節(jié)邊緣無骨贅形成。模型組造模術(shù)后4周脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)軟骨面失去正常光澤，透明度下降，軟骨面不規(guī)則；術(shù)后6周可見脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)軟骨面粗糙糜爛，色澤灰暗，周圍可見少量骨贅形成；術(shù)后8周軟骨磨損進(jìn)一步加重內(nèi)側(cè)平臺(tái)出現(xiàn)軟骨缺損，軟骨下骨質(zhì)裸露，內(nèi)側(cè)平臺(tái)周圍有大量骨贅形成(圖2)。各組評(píng)分兩兩之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖3。

a：假手術(shù)組；b：造模4周；c：造模6周；d：造模8周

組別 0分1分2分3分4分假手術(shù)組82000造模4周26200造模6周01720造模8周00361

*：與造模4周相比，P<0.05；#：與造模6周相比，P<0.05；△：與造模8周相比，P<0.05

圖3各組關(guān)節(jié)軟骨損傷評(píng)分

2.2　MMP-13在各組軟骨組織中的表達(dá)結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，MMP-13在假手術(shù)組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中呈低水平表達(dá)；在造模4周組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中的表達(dá)增加；在造模6周組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中的表達(dá)水平持續(xù)增加；在造模8周組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中的表達(dá)水平較造模6周組有所下降，但高于假手術(shù)組及造模4周組水平，見圖4。各組蛋白表達(dá)水平兩兩之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。免疫組化結(jié)果顯示假手術(shù)組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中可見少量MMP-13蛋白的表達(dá)，模型組的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中可見MMP-13蛋白的表達(dá)，軟骨細(xì)胞的胞質(zhì)可見棕黃色著色，且造模6周組較造模4周組陽性細(xì)胞百分比增加，造模8周組陽性細(xì)胞百分比較造模6周組減少，但高于假手術(shù)組及造模4周組水平，見圖6。各組蛋白表達(dá)水平兩兩之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖7。

圖4　各組蛋白印記圖

*：與造模4周相比，P<0.05；#：與造模6周相比，P<0.05；△：與造模8周相比，P<0.05

圖5Westernblot檢測各組標(biāo)本MMP-13表達(dá)水平

a：假手術(shù)組；b：造模4周；c：造模6周；d：造模8周

*：與造模4周相比，P<0.05；#：與造模6周相比，P<0.05；△：與造模8周相比，P<0.05

圖7各組MMP-13陽性細(xì)胞率

2.3　ADAMTS-5在各組軟骨組織中的表達(dá)結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，ADAMTS-5在假手術(shù)組及造模4周組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中呈低水平表達(dá)；在造模6周組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中的表達(dá)水平增加；在造模8周組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中的表達(dá)水平基本維持在造模6周組的水平，但高于假手術(shù)組及造模4周組水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖8。免疫組化結(jié)果顯示，假手術(shù)組及造模4周組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中ADAMTS-5幾乎不表達(dá)，造模6周組及造模8周組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中可見少量ADAMTS-5蛋白的表達(dá)，軟骨細(xì)胞的胞質(zhì)可見棕黃色著色，見圖9。造模6周組與造模8周組陽性細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但均高于假手術(shù)組及造模4周組水平(P<0.05)，見圖10。

*：與造模6周相比，P<0.05；#：與造模8周相比，P<0.05

3　討論

OA現(xiàn)已成為21世紀(jì)社會(huì)的主要負(fù)擔(dān)之一，疾病的進(jìn)展將導(dǎo)致關(guān)節(jié)的疼痛、無力甚至功能喪失。OA的病理變化包括關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、滑膜及相鄰的支撐結(jié)締組織不同程度的退變及炎癥性改變[4]。臨床上獲取的OA標(biāo)本主要是來源于OA晚期關(guān)節(jié)置換患者，即使同為OA晚期的標(biāo)本，不同患者具體標(biāo)本病變程度也存在差別。因此構(gòu)建動(dòng)物模型有利于對(duì)OA不同病變時(shí)期的研究。

a：假手術(shù)組；b：造模4周；c：造模6周；d：造模8周

*：與造模6周相比，P<0.05；#：與造模8周相比，P<0.05

OA模型的建立方法較多，主要包括關(guān)節(jié)制動(dòng)、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物、關(guān)節(jié)手術(shù)等方法[6]。關(guān)節(jié)制動(dòng)造模周期較長，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物會(huì)影響局部代謝微環(huán)境，相較于這兩者關(guān)節(jié)手術(shù)的方法具有造?？煽?、造模周期短等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)典的手術(shù)方式有Hulth法，該造模方法是比較常用的，通過切斷膝關(guān)節(jié)的內(nèi)側(cè)副韌帶+切斷前后交叉韌帶+切除內(nèi)側(cè)半月板來構(gòu)建OA模型[7]。但該方法由于關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞多，導(dǎo)致關(guān)節(jié)極度不穩(wěn)，模型窗口期短，且不同研究人員造模效果差異較大。國內(nèi)外學(xué)者紛紛在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，改良法中研究者們采用較多的是單純切斷前交叉韌帶方法，但該方法造模周期相對(duì)較長。我們通過離斷膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶，破壞了膝關(guān)節(jié)正常的正常力學(xué)軸線造成膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，進(jìn)一步切除內(nèi)側(cè)半月板可以去除其緩沖作用，增加了股骨內(nèi)髁及內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)關(guān)節(jié)軟骨面之間的摩擦，使內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)軟骨局部承受的壓力變大，從而加速其發(fā)生退變，很好地模擬了人類OA的發(fā)生和發(fā)展的病變過程。我們觀察到假手術(shù)組脛骨平臺(tái)關(guān)節(jié)軟骨面光滑，色澤紅潤。在造模術(shù)后4周組脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)軟骨面變得粗糙、失去光澤,造模術(shù)后6 周組脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)形成糜爛并伴有骨贅生成,而在造模術(shù)后8周組則以關(guān)節(jié)面潰瘍剝脫并伴有大量骨贅形成為主要特征。我們認(rèn)為造模術(shù)后4周、6周、8周成功地復(fù)刻了OA病變的早、中、晚期病理特征，本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)側(cè)副韌帶離斷+內(nèi)側(cè)半月板切除的手術(shù)方式成功構(gòu)建了大鼠膝OA模型。

OA是一種復(fù)雜的疾病，其發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚。主要包括生物力學(xué)及代謝因素的改變，這些改變可造成關(guān)節(jié)軟骨組織的代謝失衡，進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)行性丟失，骨贅形成以及繼發(fā)的軟骨下骨的改變[4-5]。OA的發(fā)病機(jī)制是近幾年的研究熱點(diǎn)，與關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)的細(xì)胞因子及相關(guān)蛋白有很多，涉及的主流學(xué)說主要包括細(xì)胞因子學(xué)說、金屬蛋白酶學(xué)說、自由基學(xué)說、骨內(nèi)壓增高學(xué)說等[8]。軟骨組織由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(extracllular matrix，ECM)組成。ECM既是軟骨細(xì)胞賴以生存的微環(huán)境，又在力學(xué)的傳導(dǎo)中起到一定的緩沖作用。ECM的生成和降解失衡是導(dǎo)致軟骨退變的重要原因之一。ECM由軟骨細(xì)胞合成和分泌，主要由Ⅱ型膠原、聚蛋白多糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素和水分組成。正常生理?xiàng)l件下ECM的合成和降解處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài) ，在OA的發(fā)生發(fā)展過程中，這種平衡被打破，軟骨細(xì)胞的生存環(huán)境遭到破壞[9-10]。單從金屬蛋白酶學(xué)說觀點(diǎn)來看，MMPs家族和ADAMTS家族在ECM的降解過程中發(fā)揮著重要作用。MMPs不同亞型對(duì)ECM各種成分的降解能力存在效率的差異，家族成員中MMP-13可以強(qiáng)有力的降解軟骨基質(zhì)中的Ⅱ型膠原及聚蛋白多糖。ADAMTS-5是降解聚蛋白多糖最重要的酶之一，在降解軟骨聚蛋白多糖的過程中起重要作用。Hoshi等[11]進(jìn)行了一項(xiàng)研究，他們先是采用外科手術(shù)方式誘導(dǎo)大鼠的OA模型，然后再往關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MMP-13和ADAMTS-5的小干擾RNA，觀察OA模型關(guān)節(jié)軟骨退變的情況。通過組間比較，他們認(rèn)為MMP-13和ADAMTS-5在關(guān)節(jié)軟骨退變中最起著至關(guān)重要的作用。

MMP-13又稱膠原酶3，已有研究表明，OA患者體內(nèi)MMP-13高表達(dá)，提示增高的MMP-13與軟骨降解有關(guān)[12-13]。吳宏斌等[14]采用兔膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶切斷構(gòu)建OA模型，通過對(duì)標(biāo)本軟骨中MMP-13的表達(dá)檢測，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組表達(dá)量很低,造模4周組表達(dá)率明顯增高,但造模8周組表達(dá)率卻明顯下降。馬文明等[15]研究了MMP-13在大鼠前交叉韌帶切斷加內(nèi)側(cè)半月板切除的OA模型中的表達(dá)情況，他們認(rèn)為MMP-13在OA早期表達(dá)增高，中重度期后出現(xiàn)明顯下降趨勢。唐浚洲等[16]分析了手術(shù)誘導(dǎo)的內(nèi)側(cè)不穩(wěn)定半月板小鼠OA模型中關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-13表達(dá)水平的變化，5周小鼠軟骨組織中MMP-13的表達(dá)高于對(duì)照組，術(shù)后10周軟骨組織中MMP-13進(jìn)一步增高。本研究證明了MMP-13在OA早期軟骨組織中表達(dá)升高，中期持續(xù)升高，晚期下降，與相關(guān)研究基本一致[14-16]，分析其原因可能是晚期軟骨細(xì)胞凋亡過多，數(shù)量減少，MMP-13分泌不足所致。

ADAMTS-5又稱聚集蛋白聚糖酶2，與ADAMTS-4的作用一樣，在聚蛋白多糖的降解過程中起著重要作用[17]，ADAMTS主要在聚集蛋白多糖核心蛋白球間區(qū)Glu373和Ala374位點(diǎn)進(jìn)行水解[18]。ADAMTS-4和ADAMTS-5哪種酶對(duì)ECM中聚蛋白多糖降解起主要作用目前尚不明確[19-20]。關(guān)于ADAMTS-4的研究較多，而關(guān)于ADAMTS-5的研究相對(duì)較少，且研究者們關(guān)于ADAMTS-5不同時(shí)期表達(dá)變化的意見不能統(tǒng)一。張恩水等[21]依據(jù)MRI及關(guān)節(jié)鏡下分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)OA不同時(shí)期關(guān)節(jié)液中ADAMTS-5的表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ADAMTS-5在OA早、晚期組關(guān)節(jié)液中表達(dá)量高于中期OA組，呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，認(rèn)為ADAMTS-5在骨關(guān)節(jié)炎早期和晚期軟骨破壞中均起作用。冀全博[22]采用關(guān)節(jié)鏡對(duì)人軟骨標(biāo)本進(jìn)行OA分級(jí),對(duì)OA軟骨中ADAMTS-5的表達(dá)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)ADAMTS-5的表達(dá)在早期受到抑制,在OA進(jìn)展期持續(xù)升髙,證明了其在關(guān)節(jié)軟骨ECM降解中的重要作用。本研究表明ADAMTS-5在假手術(shù)組關(guān)節(jié)組骨組織中表達(dá)量甚少，在OA早期含量與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，到中晚期表達(dá)時(shí)增加，且水平基本維持不變，說明ADAMTS-5的表達(dá)與OA的病變過程及程度密切相關(guān)。相關(guān)研究[21-22]得到不同的結(jié)果，我們分析原因可能是OA早期ADAMTS-5主要在滑膜中表達(dá)，而中晚期ADAMTS-5主要在關(guān)節(jié)軟骨組織中表達(dá)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

隨著我國人口老齡化的加快，OA的患病率會(huì)逐年增高。由于目前的治療方案并不能夠逆轉(zhuǎn)疾病的病程進(jìn)展，因此OA晚期患者只能行手術(shù)治療，耗費(fèi)著大量的人力、物力和財(cái)力。本研究成功建立了不同時(shí)期的大鼠OA模型，發(fā)現(xiàn)了不同時(shí)期軟骨組織中基質(zhì)降解酶表達(dá)的差異，可為基礎(chǔ)研究和臨床治療OA提供一定的參考。闡明OA發(fā)病機(jī)制是國內(nèi)外學(xué)者們的一項(xiàng)艱巨任務(wù)，近年來隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，OA的研究已取得了巨大進(jìn)展。進(jìn)一步探究OA的發(fā)病機(jī)制，以期未來能夠在病變?cè)缙谶M(jìn)行可逆性治療，給眾多OA患者帶去福音。

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