人參皂苷Rg1對(duì)白血病干細(xì)胞衰老的影響

　，，　，，

(1.重慶市第十三人民醫(yī)院內(nèi)科，重慶 400053；2.重慶醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與組織工程實(shí)驗(yàn)室，重慶 400032)

慢性髓細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一組起源于造血干/祖細(xì)胞的惡性克隆增殖性疾病，迄今治療仍主要采用傳統(tǒng)的大劑量聯(lián)合化療，但此法副作用大、復(fù)發(fā)率高，而且對(duì)正常機(jī)體免疫與造血系統(tǒng)有極大的損害。尋找既能抑制白血病細(xì)胞惡性增殖、誘導(dǎo)凋亡，副作用又相對(duì)較小的天然藥物已成為治療白血病的希望和重要途徑。1997年Bonnet等[1]從急性髓細(xì)胞白血病患者中分離出CD34+/CD38-的白血病前體細(xì)胞亞群，將這種細(xì)胞移植給NOD/SCID小鼠后會(huì)引發(fā)白血病，而能代表絕大多數(shù)白血病細(xì)胞(CD34+，CD38+/CD34-)的白血病原始細(xì)胞不能使NOD/SCID小鼠發(fā)生白血病。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，移植的CD34+/CD38-白血病前體細(xì)胞亞群可連續(xù)被移植給二代受體[1-2]，由此可證實(shí)該前體細(xì)胞具有自我復(fù)制能力，因此認(rèn)為這是白血病干細(xì)胞或干細(xì)胞樣細(xì)胞，盡管這種細(xì)胞僅占白血病細(xì)胞的一小部分，但由于白血病干細(xì)胞更能逃逸化療或放療，是白血病難以治愈或復(fù)發(fā)的關(guān)鍵?？梢妼ふ野籽「杉?xì)胞對(duì)治愈白血病至關(guān)重要。有研究結(jié)果表明，人參皂苷Rg1對(duì)正常造血細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞增殖分化有雙向調(diào)節(jié)作用，對(duì)正常造血細(xì)胞有延緩其衰老的作用，而對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用并能誘導(dǎo)其向成熟方向分化[3-4]。但白血病干細(xì)胞衰老情況同正常造血干細(xì)胞相比有何區(qū)別，人參皂苷Rg1對(duì)白血病干細(xì)胞的促衰老作用還未明確，本課題擬運(yùn)用現(xiàn)代衰老的檢測(cè)技術(shù)，通過測(cè)定健康人群及白血病患者骨髓CD34+/CD38-細(xì)胞群，即造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSCs)的衰老生物學(xué)變化特征并探討人參皂苷對(duì)白血病干細(xì)胞是否有促衰老的作用，以期為白血病的防治提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與分組

本研究中無明顯血液學(xué)異常者的骨髓，已確診為慢性髓細(xì)胞白血病的患者的骨髓，均由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科骨穿室提供。標(biāo)本收集得到重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并獲患者家屬知情同意。納入無血液病異常者15例(正常組)，其中男6例，45～56歲；女9例，49～58歲。慢性髓細(xì)胞白血病患者16例(白血病組)，其中男8例，40～56歲；女8例，40～62歲。取骨髓，將2組患者分別再分為對(duì)照組與Rg1組。對(duì)照組進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，即在含30%胎牛血清及1%青霉素(或鏈霉素)的低糖培養(yǎng)基中于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞孵育箱培養(yǎng)2 d。Rg1組在上述培養(yǎng)體系中另外加10 μg/mL人參皂苷Rg1，其他條件同對(duì)照組，培養(yǎng)2 d?？傻玫秸?duì)照組、正常Rg1組、白血病對(duì)照組、白血病Rg1組4個(gè)組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2　藥品與試劑

藥物與試劑包括：Human Anti-CD34 MicroBead Kit(FITC)(NO.130-046-703)、Human Anti-CD38 MicroBead Kit(NO.130-092-263)、MS磁珠分離柱(NO.130-042-201)，Buffer緩沖液、細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒、紅細(xì)胞裂解液、CCK-8試劑盒(C0037)、Ficoll分離液。

1.3　免疫磁珠分離純化人骨髓CD34+/CD38-細(xì)胞及流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定純度

腰椎穿刺獲取CML患者骨髓，經(jīng)過置于抗凝管中，上下反復(fù)顛倒混勻，置于冰盒里，將骨髓用生理鹽水洗滌2次，移入離心管，離心后加入5 mL紅細(xì)胞裂解液置于4 ℃冰箱5 min，生理鹽水洗滌，參照說明書，分離采集骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bone marrow nucleated cells,BMNCs)，離心后用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)。取BMNCs 1×108個(gè)細(xì)胞加入800 μL Buffer及200 μL human anti-CD38-PE 免疫磁珠抗體，輕輕吹打混勻，避光4 ℃孵育10 min，加入800 μL Buffer及200 μL anti-biotin 微珠，再避光4 ℃孵育30 min。將MS分選柱置于分離器磁場(chǎng)中，用干細(xì)胞專用Buffer 沖洗MS柱2次。用一次性巴氏管將孵好抗體的細(xì)胞加入分選柱中使其自然流下，分選出的細(xì)胞即為CD38-細(xì)胞，再取1×108個(gè)CD38-細(xì)胞加入100 μL Fcr blocking reagent、100 μL CD34 microbeads和300 μL Buffer，輕輕吹打混勻后4 ℃避光孵育30 min。按之前的方法將孵好抗體的細(xì)胞懸液緩緩加到MS分選柱中，即將流盡時(shí)加1 mL Buffer沖洗2次，向MS柱中加入1 mL Buffer，用美天旎MS分選柱配套的活塞迅速推出柱子里的細(xì)胞，推出的細(xì)胞即為實(shí)驗(yàn)需要的人骨髓CD34+/CD38-細(xì)胞。

1.4　臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞的存活率

分別采集各組CD34+/CD38-細(xì)胞懸液各90 μL，加入4 g/L 的臺(tái)盼藍(lán)染液10 μL，混勻，靜置3 min，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，透明不著色細(xì)胞為活細(xì)胞，著色脹大、呈淡藍(lán)色為死細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞百分比?；罴?xì)胞率=[活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%]。

1.5　各組CD34+/CD38-細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色

分別收集各組人骨髓CD34+/CD38-細(xì)胞各1×105個(gè)，參照細(xì)胞衰老β半乳糖苷酶染色試劑盒說明書方法對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行染色。染色陽性細(xì)胞呈藍(lán)色，倒置相差顯微鏡下觀察200個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分率。

1.6　各組CD34+/CD38-細(xì)胞形成造血干/祖細(xì)胞集落能力比較

分別取各組CD34+/CD38-細(xì)胞各4×104個(gè)細(xì)胞，用移液槍緩慢吸取并加入1 mL混合集落專用培養(yǎng)基，混勻后分別按0.5 mL/孔加入24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用顯微鏡每天觀察細(xì)胞形態(tài)，記錄各組集落生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)至第7天后計(jì)數(shù)各組混合集落數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7　CCK-8 試劑盒檢測(cè)各組CD34+/CD38-細(xì)胞的增殖能力

在96 孔板中分別加入各組CD34+/CD38-細(xì)胞，每孔2×104個(gè)細(xì)胞，96孔板周圍一排孔不加細(xì)胞，只加100 μL PBS緩沖液作為空白對(duì)照，每孔再加入10 μL CCK-8 溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育4 d，每天分別用酶標(biāo)儀調(diào)節(jié)到450 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)的吸光度值(A450)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8　各組CD34+/CD38-細(xì)胞的細(xì)胞周期時(shí)相比較

收集各組CD34+/CD38-細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌1次，70%的冰乙醇固定過夜，再用PBS緩沖液洗滌2次，加入100 μL牛胰核糖核酸酶(1 g/L)，37 ℃水浴孵育30 min；加入50 mg/L的碘化丙啶染色液避光反應(yīng)30 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，再用Multicycle軟件分析各組細(xì)胞的細(xì)胞周期時(shí)相。

1.9　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1　MACS分選前后CD34+/CD38-細(xì)胞純度比較

按照已發(fā)表的免疫磁珠改良分選方法[23]可分選出純度較高的人骨髓CD34+/CD38-細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)結(jié)果顯示，分選前每1×106個(gè)BMNCs中CD34+/CD38-細(xì)胞群比例為(1.76±0.34)%；免疫磁性分選后每1×106個(gè)細(xì)胞中CD34+/CD38-細(xì)胞群比例為(91.15±2.41)%，見圖1。

a:分選前;b:分選后

2.2　臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞的存活率結(jié)果

各組人骨髓CD34+/CD38-細(xì)胞存活率均可達(dá)到98%以上，正常對(duì)照組，正常Rg1組，白血病正常組，白血病Rg1組分別為(98.06±0.65)%，(99.16±0.52)%，(99.4±0.27)%，(99.0±0.5)%，且各組人骨髓CD34+/CD38-細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明分離的細(xì)胞純化高、活性好，各組間無差異，均可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

2.3　骨髓CD34+/CD38-細(xì)胞SA-β-半乳糖苷酶染色結(jié)果

SA-β-半乳糖苷酶染色顯示陽性細(xì)胞著藍(lán)色，胞漿內(nèi)可見藍(lán)色顆粒；陰性細(xì)胞未著色。白血病對(duì)照組CD34+/CD38-細(xì)胞SA-β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞率為(5.45±0.15)%，明顯低于正常對(duì)照組的(11.5±1.74)%與正常Rg1組的(9.81±0.89)%，說明慢性髓細(xì)胞白血病患者的CD34+/CD38-細(xì)胞，即白血病干細(xì)胞較健康人的CD34+/CD38-細(xì)胞出現(xiàn)逆衰老。而白血病Rg1組的SA-β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞率(8.74±0.45)%，相比白血病對(duì)照組出現(xiàn)升高，說明人參皂苷Rg1可能誘導(dǎo)白血病干細(xì)胞趨向了衰老。

2.4　骨髓CD34+/CD38-細(xì)胞CFU-Mix形成能力

各組CD34+/CD38-細(xì)胞CFU-Mix形成檢測(cè)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組CFU-Mix形成(4.58±0.76)個(gè)/104、正常Rg1組(5.34±0.68)個(gè)/104、白血病對(duì)照組(8.69±0.71)個(gè)/104、白血病Rg1組(6.55±0.24)個(gè)/104。白血病對(duì)照組CFU-Mix形成率明顯高于正常對(duì)照組與正常Rg1組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。白血病患者的CD34+/CD38-細(xì)胞較健康人的CD34+/CD38-細(xì)胞增殖能力大大增加，集落細(xì)胞增大，排列不規(guī)則，即出現(xiàn)異常增殖，具有白血病干細(xì)胞的特質(zhì)。而白血病Rg1組CD34+/CD38-的增殖速率相比白血病對(duì)照組出現(xiàn)下降，說明人參皂苷Rg1可以有效抑制CD34+/CD38-細(xì)胞的異常增殖情況。

2.5　骨髓CD34+/CD38-細(xì)胞增殖生長(zhǎng)能力比較

各組CD34+/CD38-細(xì)胞CCK-8檢測(cè)結(jié)果提示，白血病對(duì)照組增殖能力明顯高于正常對(duì)照組與正常Rg1組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明慢性髓細(xì)胞白血病患者的CD34+/CD38-細(xì)胞成為白血病干細(xì)胞較健康人的CD34+/CD38-細(xì)胞增殖能力大大增加，即出現(xiàn)異常增殖。而白血病Rg1組的增殖速率相比白血病對(duì)照組出現(xiàn)明顯下降，說明人參皂苷Rg1可以有效抑制白血病干細(xì)胞的異常增殖情況，見圖2。

2.6　各組人骨髓CD34+/CD38-細(xì)胞的細(xì)胞周期時(shí)相的比較

正常對(duì)照組及正常Rg1組較白血病對(duì)照組出現(xiàn)明顯的G1期阻滯， 其G0/G1期比例明顯增高，S期比例減少，說明白血病對(duì)照組的細(xì)胞進(jìn)入分裂期比例高，增殖活躍；白血病Rg1組的G1期阻滯相比白血病對(duì)照組有所升高，說明Rg1可以促進(jìn)白血病干細(xì)胞進(jìn)入G1期，減慢白血病干細(xì)胞的增殖。而正常Rg1組較正常對(duì)照組其G0/G1期比例明顯降低，S期比例增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。說明Rg1對(duì)正常細(xì)胞具有延緩其衰老速度的作用。

圖2　CCK-8檢測(cè)各組人CD34+/CD38-細(xì)胞增殖能力

組別 nG0/G1期G2/M期S期正常對(duì)照組 1590.7±3.32.2±1.26.1±0.5正常Rg1組 1585.5±2.94.1±1.58.9±1.3白血病對(duì)照組1671.1±3.2*8.3±1.9*19.6±2.7*白血病Rg1組167.3±1.16.7±2.115.3±0.5

*：與其余各組比較，P<0.05

3　討論

作為造血系統(tǒng)先祖，造血干細(xì)胞負(fù)責(zé)終身生產(chǎn)所有類型的血細(xì)胞。這種功能性能力及血細(xì)胞數(shù)量隨年齡顯著改變，免疫缺陷和貧血被認(rèn)為是老年人群發(fā)病率和病死率增加的主要因素[5]。適應(yīng)性和包括淋巴免疫系統(tǒng)(B、T淋巴細(xì)胞)與骨髓白細(xì)胞在內(nèi)的先天免疫系統(tǒng)的協(xié)調(diào)誘發(fā)免疫反應(yīng)。隨著年齡的增加，幼稚T細(xì)胞的產(chǎn)生顯著下降，記憶和效應(yīng)T細(xì)胞積累和克隆擴(kuò)增顯著，可導(dǎo)致老年人免疫防御下降，自身免疫增加[6]。B細(xì)胞的數(shù)量隨著年齡的增長(zhǎng)而降低，而且衰老的B細(xì)胞生成的抗體親和力和多樣性降低[7]。和淋巴系細(xì)胞群相比，髓系細(xì)胞群隨年齡增加而擴(kuò)大，這使體內(nèi)形成了一種促炎環(huán)境，成為生活的不利因素[8]。此外，其他類免疫細(xì)胞，如自然殺傷細(xì)胞和樹突狀抗原呈遞細(xì)胞，已被證實(shí)在老年人機(jī)體里數(shù)量減少和功能衰退[9-10]。這些“免疫衰老”和“炎性衰老”顯型在許多老年人群病理性的重大健康問題中都有涉及，如癌癥、自身免疫性疾病、慢性炎癥性紊亂。

衰老伴隨著基因損傷積累、端?？s短以及代謝產(chǎn)物的負(fù)擔(dān)。所有這些細(xì)胞的變化可激活參與凋亡、衰老或受損細(xì)胞增殖的多個(gè)信號(hào)通路，最終導(dǎo)致衰老干細(xì)胞的功能下降[11-16]。老年人(大于65歲)骨髓造血干細(xì)胞的增殖特性明顯高于年輕人(20～30歲)[11-12]。老年人造血干細(xì)胞異種移植到免疫缺陷小鼠不會(huì)像年輕人的細(xì)胞有效地產(chǎn)生淋巴系后代[11]。

腫瘤干細(xì)胞是研究腫瘤極其重要的模型，將干細(xì)胞、促腫瘤干細(xì)胞衰老與抑制腫瘤生長(zhǎng)密切結(jié)合，深入研究腫瘤干細(xì)胞和促腫瘤干細(xì)胞衰老的現(xiàn)代生物學(xué)機(jī)理，尋找促腫瘤干細(xì)胞衰老的方法對(duì)抑制腫瘤生長(zhǎng)的研究有重大科學(xué)意義。慢性髓系白血病是一組起源于造血干/祖細(xì)胞的惡性克隆增殖性疾病，迄今治療仍主要采用大劑量聯(lián)合化療，此法副作用大、復(fù)發(fā)率高，且對(duì)正常機(jī)體免疫與造血系統(tǒng)有極大的損害。尋找既能抑制白血病細(xì)胞惡性增殖、誘導(dǎo)凋亡，副作用又相對(duì)較小的天然藥物已成為治療白血病新的思路。白血病干細(xì)胞異常增生與分化與白血病有密切的聯(lián)系。我們最近研究證明，衰老白血病干細(xì)胞的β半乳糖苷酶(SA-β-gal)表達(dá)顯著升高；G1期細(xì)胞的百分比增高；體外培養(yǎng)形成CFU-Mix能力降低[12-16]。

近年來我們探索了Rg1對(duì)白血病干細(xì)胞衰老調(diào)控作用，初步結(jié)果已提示，人參皂苷Rg1對(duì)正常造血干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞增殖分化有雙向調(diào)節(jié)作用，對(duì)腫瘤干細(xì)胞的增殖有明顯抑制并能誘導(dǎo)其向成熟方向分化?；谖覀兗韧ぷ鞣e累和復(fù)習(xí)文獻(xiàn)，我們推測(cè)Rg1能通過調(diào)控LSCs等腫瘤干細(xì)胞衰老對(duì)腫瘤起到輔助治療作用。如果這一理論被證實(shí)，不僅對(duì)中醫(yī)藥的衰老與抗衰老理論、中醫(yī)藥對(duì)干細(xì)胞的認(rèn)識(shí)、建立干細(xì)胞衰老研究平臺(tái)、篩選天然藥物抗衰老有效成分均有重要貢獻(xiàn)，而且對(duì)臨床腫瘤治療新途徑摸索也有重要意義[17-23]。

通過本研究得知慢性髓細(xì)胞白血病患者的CD34+/CD38-細(xì)胞，即白血病干細(xì)胞，較健康人的CD34+/CD38-細(xì)胞出現(xiàn)逆衰老，不僅體現(xiàn)在白血病Rg1組CD34+/CD38-細(xì)胞的SA-β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞率比白血病對(duì)照組高，還體現(xiàn)在增殖能力，白血病對(duì)照組的CD34+/CD38-細(xì)胞集落數(shù)量明顯高于其他組，集落中的細(xì)胞數(shù)也高于其他組，細(xì)胞雜亂無章，且細(xì)胞體積增大。說明慢性髓細(xì)胞白血病患者的CD34+/CD38-細(xì)胞較健康人的CD34+/CD38-細(xì)胞增殖能力大大增加，集落細(xì)胞增大，排列不規(guī)則，即異常增殖。從細(xì)胞周期情況來看，正常對(duì)照組及正常Rg1組較白血病對(duì)照組出現(xiàn)明顯的G1期阻滯， 其G0/G1期比例明顯增高，S期比例減少，而白血病對(duì)照組多數(shù)CD34+/CD38-細(xì)胞進(jìn)入S期，意味著其具有活躍的增生能力。CCK-8增殖曲線可以看出白血病未干預(yù)組的增殖速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于其他兩組，且對(duì)應(yīng)時(shí)間的細(xì)胞數(shù)量也高于其他組。而各實(shí)驗(yàn)中白血病Rg1組的增殖速率及增殖能力相比白血病對(duì)照組出現(xiàn)下降，說明人參皂苷Rg1可以有效抑制白血病干細(xì)胞的異常增殖情況。而在細(xì)胞衰老實(shí)驗(yàn)中，白血病Rg1組的SA-β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞率明顯高于白血病對(duì)照組，說明人參皂苷Rg1可能是通過誘導(dǎo)白血病干細(xì)胞趨向了衰老來削弱其增殖能力的。

白血病患者由于某些惡劣因素的影響可能會(huì)導(dǎo)致造血干細(xì)胞增殖性增強(qiáng)，趨于惡性化，演變成白血病干細(xì)胞，導(dǎo)致造血系統(tǒng)惡性腫瘤，這可能是白血病的治療效果不好，容易復(fù)發(fā)的根本原因。本研究提示，人參皂苷Rg1可誘導(dǎo)白血病干細(xì)胞衰老抑制白血病干細(xì)胞的增殖分化，控制惡性腫瘤細(xì)胞大量擴(kuò)增，進(jìn)而控制慢性髓細(xì)胞白血病病情的發(fā)展，后續(xù)研究我們將深入研究其機(jī)制及臨床應(yīng)用的可行性，以期為白血病的防治提供參考依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Bonnet D,Dick JE.Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell[J].Nat Med,1997,3(7):730-737.

[2] Wagner W,Bork S,Horn P,et al.Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells[J].PloS One,2009,4(6):e5846.doi:10.1371/journal.pone.0005846.

[3] Zhu J,Mu X,Zeng J,et al.Ginsenoside Rg1 prevents cognitive impairment and hippocampus senescence in a rat model of D-Galactose-Induced Aging[J].PloS One,2014,9(6):e101291.doi:10.1371/journal.pone.0101291.

[4] Li J,Cai D,Yao X,et al.Protective effect of ginsenoside Rg1 on hematopoietic stem/progenitor cells through attenuating oxidative stress and the Wnt/β-Catenin signaling pathway in a mouse model of d-Galactose-induced aging[J].Int J Mol Sci, 2016,17(6):849.doi:10.3390/ijms17060849.

[5] Han S,Yang K,Ozen Z et al.Enhanced differentiation of splenic plasma cells but diminished long-lived high-affinity bone marrow plasma cells in aged mice[J].J Immunol,2003,170(3):1267-1273.

[6] Franceschi C,Capri M,Monti D,et al.Inflammaging and anti-inflammaging: A systemic perspective on aging and longevity emerged from studies in humans[J].Mech Ageing Dev,2007,128(1):92-105.doi:10.1016/j.mad.2006.11.016.

[7] Mocchegiani E,Malavolta M.NK and NKT cell functions in immunosenescence[J].Aging Cell,2004,3(4):177-184.doi:10.1111/j.1474-9728.2004.00107.x.

[8] Uyemura K,Castle SC,Makinodan T.The frail elderly:role of dendritic cells in the susceptibility of infection[J].Mech Ageing Dev,2002,123(8):955-962.

[9] Pang WW,Price EA,Sahoo D et al.Human bone marrow hematopoietic stem cells are increased in frequency and myeloid-biased with age[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(50):20012-20017.doi:10.1073/pnas.1116110108.

[10] Kuranda K,Vargaftig J,de la Rochere P,et al.Age-related changes in human hematopoietic stem/progenitor cells[J].Aging Cell,2011,10(3):542-546.doi:10.1111/j.1474-9726.2011.00675.x.

[11] Notta F,Doulatov S,Laurenti E,et al.Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment[J].Science,2011,333(6039):218-221.doi:10.1126/science.1201219.

[12] Sahin E,Depinho RA.Linking functional decline of telomeres,mitochondria and stem cells during ageing[J].Nature,2010,464(7288):520-528.doi:10.1038/nature08982.

[13] Yahata T,Takanashi T,Muguruma Y,et al.Accumulation of oxidative DNA damage restricts the self-renewal capacity of human hematopoietic stem cells[J].Blood,2011,118(11):2941-2950. doi:10.1182/blood-2011-01-330050.

[14] Mantel C,Messina-Graham S,Moh A,et al.Mouse hematopoietic cell-targeted STAT3 deletion:stem/progenitor cell defects,mitochondrial dysfunction,ROS overproduction,and a rapid aging-like phenotype[J].Blood,2012,120(13):2589-2599.doi:10.1182/blood-2012-01-404004.

[15] Liang Y,Van Zant G,Szilvassy SJ.Effects of aging on the homing and engraftment of murine hematopoietic stem and progenitor cells[J].Blood,2005,106(4):1479-1487.doi:10.1182/blood-2004-11-4282.

[16] Chen C,Mu X,Zhou Y,et al.Ginsenoside Rg1 enhances the resistance of hematopoietic stem/progenitor cells to radiation-induced aging in mice[J].Acta Pharmacologica Sinica,2014,35(1):143-150.doi:10.1038/aps.2013.136.

[17] Hu W,Jing P,Wang L,et al.The positive effects of Ginsenoside Rg1 upon the hematopoietic microenvironment in a D-Galactose-induced aged rat model[J].BMC Complement Altern Med,2015,15:119.doi:10.1186/s12906-015-0642-3.

[18] Gazit R,Weissman IL,Rossi DJ.Hematopoietic stem cells and the aging hematopoietic system[J].Semin Hematol,45(4):218-224.doi:10.1053/j.seminhematol.2008.07.010.

[19] Chambers SM,Shaw CA,Gatza C,et al.Aging hematopoietic stem cells decline in function and exhibit epigenetic dysregulation[J].PloS Biol,2007,5(8):e201.doi:10.1371/journal.pbio.0050201.

[20] Challen GA,Boles N,Lin KK,et al.Mouse hematopoietic stem cell identification and analysis[J].Cytometry A,2009,75(1):14-24.doi:10.1002/cyto.a.20674.

[21] Kent DG,Copley MR,Benz C,et al.(2009) Prospective isolation and molecular characterization of hematopoietic stem cells with durable self-renewal potential[J].Blood,2009,13(25):6342-6350.doi:10.1182/blood-2008-12-192054.

[22] Yue Zhou,Bing Yang,Xin Yao,et al.Establishment of an aging model of Sca-1+hematopoietic stem cell and studies on its relative biological mechanisms[J].In Vitro Cell Dev Biol-Animal,2010,47(2):149-153.doi:10.1007/s11626-010-9372-5.

[23] 耿珊,張琛,劉俊,等.免疫磁性活化細(xì)胞分選方法優(yōu)化及純化后細(xì)胞的生物學(xué)特性檢測(cè)[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2012,28(7):752-754.