國產(chǎn)血漿游離DNA提取試劑盒的性能評(píng)價(jià)

潘杰，吳玉梅，*，趙琪，趙蘭靜，吳茵，朱菊平，黃學(xué)文

（1.華東療養(yǎng)院檢驗(yàn)科，江蘇無錫214065；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇無錫214023）

游離 DNA（free circulating／cell-free DNA，cfDNA）是一種無細(xì)胞狀態(tài)的、片段化的胞外DNA，主要存在于血液、滑膜液和腦脊液等體液中。目前cfDNA在無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)和腫瘤的液態(tài)活檢方面應(yīng)用較廣。除此之外，cfDNA在器官移植、腦卒中、自身免疫病和心肌梗死等疾病上的應(yīng)用價(jià)值也日益清晰［1－3］。目前，對(duì)cfDNA提取質(zhì)量缺乏統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［4－5］。cfDNA在血漿內(nèi)的含量極低，大致范圍在15～40 ng／mL，在如此低豐度的情況下，采用紫外波長等傳統(tǒng)方法得到的定量結(jié)果往往不準(zhǔn)確［6－8］。因此，如何正確評(píng)價(jià)cfDNA的提取質(zhì)量是急需解決的問題之一。目前硅膠膜吸附柱提取方法是cfDNA提取量最大最純的一種方法，市場(chǎng)上最主要的產(chǎn)品為Qiagen公司的QIAamp游離核酸提取試劑盒（Qiagen CNA kit），其在cfDNA提取領(lǐng)域具有非常大的壟斷性。本研究將從cfDNA的提取效率、cfDNA的片段分布以及不同片段DNA的回收率等方面評(píng)價(jià)國產(chǎn)cfDNA提取試劑盒的性能，以期掌握更好更經(jīng)濟(jì)的cfDNA提取方法。

1　材料與方法

1.1　對(duì)象

選取200例2016年10月20日來華東療養(yǎng)院體檢的人員作為志愿者，平均年齡42.6歲（35～55歲）。全部志愿者乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物和丙型肝炎病毒血清抗體均為陰性，肝腎功能、血脂和尿酸等生化指標(biāo)正常，超聲波檢查證實(shí)肝、膽、脾、胰、腎無異常，X線、CT及內(nèi)窺鏡檢查均正常。

1.2　方法

1.2.1血漿池A的制備 所有志愿者均于體檢時(shí)空腹抽取靜脈血4 mL，加入含EDTA的BD抗凝管中。1 900×g離心10 min，轉(zhuǎn)移上層血漿至新1.5 mL EP管中，16 000×g離心10 min。吸取上清液，將所有上清液混合構(gòu)成血漿池A，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2cfDNA提取 用 Qiagen CNA kit和游離DNA大量提取試劑盒（江蘇昱安生物科技有限公司），按照說明書分別提取1、2、3和5 mL血漿池A中的cfDNA 3次。4 mL血漿池每天提取2次，10 d共提取20次。提取物－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3cfDNA濃度檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)［4］報(bào)道，血漿中的β-球蛋白基因濃度可以代表血漿中cfDNA濃度，因此用102 bp的β-球蛋白基因片段的熒光定量PCR的Ct值代表cfDNA濃度。用TaqMan qPCR體系（TaKaRa公司）在熒光定量PCR儀上（ABI ViiATM7DX熒光定量PCR儀）檢測(cè)血漿池A提取物中β-球蛋白基因含量。具體步驟：2×PCR緩沖液12.5μL，10μmol／L的 β-球蛋白基因上下游引物各0.5μL，10μmol／L的 TaqMan-BHQ1探針0.75μL，50×ROX液 0.25μL，DEPC水 0.5μL，提取物 10 μL，總體積25μL。擴(kuò)增條件為95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。β-球蛋白基因的上、下游引物及TaqMan-BHQ1探針由上海英駿公司合成，序列見表1。

1.2.4PCR分析 cfDNA片段 在 ABIVERITI梯度PCR儀上，用普通PCR體系（江蘇昱安生物科技有限公司）分別擴(kuò)增4 mL血漿池A提取物中102和268 bp的β-球蛋白基因片段以及402和1 204 bp的p53基因片段。具體步驟：2×PCR緩沖液12.5 μL，10μmol／L的上下游引物各 0.5μL，提取物 5 μL，DEPC水6.5μL，總體積 25μL。擴(kuò)增條件：94℃ 1 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共 35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。上下游引物由上海英駿公司合成，序列見表1。

表1　引物及探針序列

1.2.5PCR產(chǎn)物純化及定量 用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（江蘇昱安生物科技有限公司）分別純化102、268和402 bp的PCR產(chǎn)物，核酸測(cè)定儀分別測(cè)定濃度。各取50μL純化后的102、268和402 bp片段混合，核酸測(cè)定儀測(cè)定濃度。

1.2.6血漿池B1－B4的制備 在0.94 mL血漿池A中分別加入60μL已知濃度的片段長度為102、268和402 bp的純化后的PCR產(chǎn)物及其混合物，形成1 mL血漿池B1－B4。

1.2.7血漿池B1－B4中不同DNA片段的回收率計(jì)算 用Qiagen CNA kit和游離DNA大量提取試劑盒（江蘇昱安生物科技有限公司），按照說明書分別提取1 mL血漿池B1－B4中的cfDNA，每個(gè)血漿池每天重復(fù)提取cfDNA 2次，10 d共提取20次。以1 mL血漿池 A的提取物調(diào)零，核酸測(cè)定儀（NV3000C，VASTECH公司）分別測(cè)定核酸濃度，計(jì)算回收率，回收率＝回收后所獲得DNA量／回收前加入的DNA量。同時(shí)，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察回收效果。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)；血漿用量與cfDNA的Ct值關(guān)系分析采用線性相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　兩種試劑盒提取的血漿池A中cfDNA濃度比較

熒光定量PCR結(jié)果表明，4 mL血漿池A血漿中，Qiagen和國產(chǎn)提取物中cfDNA含量的平均Ct值分別為27.94±0.423和27.41±0.356，兩種方法的Ct值差異明顯（t＝4.29，P＜0.01）。Qiagen和國產(chǎn)提取物中 cfDNA含量的 CV值分別為1.51%和1.30%。

2.2　兩種試劑盒提取的血漿池A中cfDNA片段分析

PCR結(jié)果表明，兩種方法的提取物在102、268和402 bp處均出現(xiàn)明顯條帶，而1 204 bp片段未出現(xiàn)。電泳結(jié)果還表明，國產(chǎn)試劑在102、268和402 bp處的條帶強(qiáng)度明顯高于Qiagen產(chǎn)品（圖1）。

圖1　血漿游離DNA片段長度分析結(jié)果

2.3　血漿池B1－B4中不同片段DNA的回收率比較

結(jié)果見表2，兩者在102 bp和268 bp片段的回收率上差異顯著（t＝5.69，P＜0.01；t＝3.44，P＜0.01），而在402 bp及混合物的回收率上無明顯差異（t＝0.47，P＞0.05；t＝1.39，P＞0.05）。Qiagen CNA kit和國產(chǎn)試劑盒回收率的平均CV值為6.28%和6.09%。同時(shí)，電泳結(jié)果進(jìn)一步證明了不同片段DNA的回收效果（圖2、圖3）。

表2　兩種試劑對(duì)血漿池B1－B4中不同DNA片段回收率的比較

圖2　國產(chǎn)提取試劑不同DNA片段回收前后電泳結(jié)果

圖3　兩種提取試劑不同DNA片段回收后電泳結(jié)果比較

2.4　血漿用量與cfDNA的Ct值關(guān)系分析

1、2、3、4和5 mL血漿池A血漿中提取的cfDNA定量分析結(jié)果表明，Qiagen和國產(chǎn)試劑盒的血漿用量與Ct值存在負(fù)相關(guān)，線性方程式分別為Y＝－0.468X＋29.85，r2＝0.979（P＜0.01）；Y＝－0.432X＋29.35，r2＝0.963（P＜0.01）。見圖4。

圖4　兩種試劑上樣量與cfDNA的Ct值的關(guān)系

3　討論

cfDNA正在成為產(chǎn)前檢測(cè)、癌癥診斷和監(jiān)測(cè)的重要臨床分析物。因?yàn)楂@得相對(duì)容易及無創(chuàng)性特點(diǎn)，cfDNA作為“液體組織”已經(jīng)顯示出了非常重要的臨床應(yīng)用前景［1－3］。目前，妨礙cfDNA成為一種強(qiáng)大的臨床分析物的主要因素之一就是提取物缺乏標(biāo)準(zhǔn)化和適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量控制。最近，在影響分析效果的樣品前處理和儲(chǔ)存等方面取得了進(jìn)展［9－11］，但提取方法和定量方法仍然是實(shí)驗(yàn)誤差的主要來源［4］。cfDNA在血漿（血清）中含量非常低，一般只有15～40 ng／mL，其提取質(zhì)量對(duì)分析方法的敏感性至關(guān)重要。因此，需要質(zhì)量控制來測(cè)量提取效率、片段大小以及提取物對(duì)下游檢測(cè)的影響。研究表明，不同方法提取效率可能有很大差異［5－7］。文獻(xiàn)報(bào)道Qiagen CNA kit是目前市場(chǎng)上最好的cfDNA提取方法之一［8］，我們通過與Qiagen試劑盒的比較，評(píng)價(jià)國產(chǎn)cfDNA提取試劑盒的性能。

血漿cfDNA的片段長度多集中在100～400 bp，基本無大于1 000 bp的cfDNA片段，而腫瘤來源的 cfDNA主要集中在 200～400 bp之間［12－13］，胎兒cfDNA通常比母體 cfDNA片段更?。?4］。因此，cfDNA片段大小分析是評(píng)價(jià)cfDNA提取試劑盒的關(guān)鍵，所有方法提取的cfDNA必須體現(xiàn)血漿中cfDNA高度片段化的特征［15－16］。本研究對(duì)國產(chǎn)試劑盒進(jìn)行cfDNA片段大小的分析結(jié)果表明，國產(chǎn)試劑提取的cfDNA在102、268和402 bp處均出現(xiàn)明顯條帶，而1 204 bp片段未出現(xiàn)，結(jié)果與血漿中cfDNA高度片段化的特征相一致。且國產(chǎn)試劑在102、268和402 bp處的條帶強(qiáng)度明顯高于Qiagen產(chǎn)品，說明國產(chǎn)試劑盒在提取效率上可能高于Qiagen產(chǎn)品。

在許多cfDNA研究中使用的提取方法，最初被開發(fā)主要是用于從血細(xì)胞或病毒粒子中提取高度完整的基因組DNA，而不是高度片段化的cfDNA。因此，不同提取方法可能對(duì)不同片段DNA具有不同的提取效果。為了評(píng)價(jià)國產(chǎn)試劑盒對(duì)小片段DNA的提取效果，本研究在血漿池A加入固定濃度不同長度的DNA片段，觀察國產(chǎn)試劑對(duì)不同長度DNA片段的提取效率。結(jié)果表明，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的Qiagen CNA kit的cfDNA回收率約為90%相一致［10］。同時(shí)，國產(chǎn)試劑盒在短片段的提取效率上要優(yōu)于Qiagen CNA kit，而在稍大片段的DNA提取效率上與Qiagen CNA kit無異。另外，cfDNA提取的穩(wěn)定性和重復(fù)性也是評(píng)價(jià)試劑盒優(yōu)劣的一個(gè)指標(biāo)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［8］，Qiagen CNA kit的平均 CV值小于10%，其他一些試劑盒的平均CV值可能高達(dá)50%。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明Qiagen CNA kit的平均CV值為6.28%，國產(chǎn)試劑的平均CV值為6.09%。說明國產(chǎn)試劑盒同樣具有很高的提取穩(wěn)定性和重復(fù)性。

除了提取回收效率之外，cfDNA總量分析也十分重要。cfDNA的總量變化在胎兒非整倍體分析［17］和癌癥相關(guān)拷貝數(shù)變化中應(yīng)用廣泛［6］。為了定量分析cfDNA的濃度，我們用熒光定量PCR方法分析了提取物中cfDNA濃度。結(jié)果表明，4 mL血漿池A國產(chǎn)和Qiagen的提取物中β-球蛋白基因的Ct值分別為27.41±0.356和27.94±0.423，兩種方法的Ct值差異明顯。國產(chǎn)和Qiagen的提取物中β-球蛋白基因Ct值的CV值分別為1.30%和1.51%。結(jié)果進(jìn)一步證明國產(chǎn)試劑在提取效率和提取穩(wěn)定上均有很好的效果。

cfDNA提取血漿用量通常為1 mL，為了監(jiān)測(cè)提取效率和提取產(chǎn)率的線性，我們分析了不同血漿用量與cfDNA濃度的關(guān)系。結(jié)果表明，國產(chǎn)試劑盒與Qiagen的上樣量與Ct值均存在負(fù)相關(guān)，血漿用量增加，總cfDNA產(chǎn)量增加，在5 mL范圍內(nèi)血漿用量與cfDNA產(chǎn)量呈線性關(guān)系。

綜上所述，本研究建立了一種評(píng)價(jià)cfDNA提取優(yōu)劣的方法，為選擇cfDNA提取試劑盒提供了依據(jù)；研究同時(shí)表明，國產(chǎn)cfDNA提取方法在各項(xiàng)評(píng)價(jià)性能上均可與Qiagen產(chǎn)品媲美。

［參考文獻(xiàn)］

［1］Stroun M，Anker P，Lyautey J，et al.Isolation and characterization of DNA from the plasma of cancer patients［J］.Eur JCancer Clin Oncol，1987，23（6）：707－712.

［2］Page K，Hava N，Ward B，et al.Detection of HER2 amplification in circulating free DNA in patients with breast cancer［J］.Br JCancer，2011，104（8）：1342－1348.

［3］Benn P，Cuckle H，Pergament E.Non-invasive prenatal testing for aneuploidy：current status and future prospects［J］.Ultrasound Obstet Gynecol，2013，42（1）：15－33.

［4］Fleischhacker M，Schmidt B，Weickmann S，et al.Methods for isolation of cell-free plasma DNA strongly affect DNA yield［J］.Clin Chim Acta，2011，412（23／24）：2085－2088.

［5］Repiska G，Sedlackova T，Szemes T，etal.Selection of the optimalmanualmethod of cell free fetal DNA isolation from maternal plasma［J］.Clin Chem Lab Med，2013，51（6）：1185－1189.

［6］Page K，Guttery DS，Zahra N，et al.Influence of plasma processing on recovery and analysis of circulating nucleic acids［J］.PLoSOne，2013，8（10）：e77963.

［7］Holmberg RC，Gindlesperger A，Stokes T，etal.Akonni TruTip?and Qiagen?methods for extraction of fetal circulating DNA-evaluation by real time and digital PCR［J］.PLoSOne，2013，8（8）：e73068.

［8］Devonshire AS，Whale AS，Gutteridge A，et al.Towards standardisation of cell-free DNA measurement in plasma：controls for extraction efficiency，fragment size bias and quantification［J］.Anal Bioanal Chem，2014，406（26）：6499－6512.

［9］Barrett AN，Zimmermann BG，Wang D，et al.Implementing prenatal diagnosis based on cell-free fetal DNA：accurate identification of factors affecting fetal DNA yield［J］.PLoSOne，2011，6（10）：e25202.

［10］Wong D，Moturi S，Angkachatchai V，etal.Optimizing blood collection，transportand storage conditions for cell free DNA increases access to prenatal testing［J］.Clin Biochem，2013，46（12）：1099－1104.

［11］Hidestrand M，StokowskiR，Song K，etal.Influence of temperature during transportation on cell-free DNA analysis［J］.Fetal Diagn Ther，2012，31（2）：122－128.

［12］Wang BG，Huang HY，Chen YC，etal.Increased plasma DNA integrity in cancer patients［J］.Cancer Res，2003，63（14）：3966－3968.

［13］Giacona MB，Ruben GC，Iczkowski KA，et al.Cellfree DNA in human blood plasma：length measurements in patients with pancreatic cancer and healthy controls［J］.Pancreas，1998，17（1）：89－97.

［14］Jorgez CJ，Bischoff FZ.Improving enrichment of circulating fetal DNA for genetic testing：size fractionation followed by whole gene amplification［J］.Fetal Diagn T-her，2009，25（3）：314－319.

［15］Clausen FB，Krog GR，Rieneck K，et al.Improvement in fetal DNA extraction from maternal plasma.Evaluation of the NucliSensmagnetic extraction system and the QIAamp DSP virus kit in comparison with the QIAamp DNA blood mini kit［J］.Prenat Diagn，2007，27（1）：6－10.

［16］Xue X，Teare MD，Holen I，et al.Optimizing the yield and utility of circulating cell-free DNA from plasma and serum［J］.Clin Chim Acta，2009，404（2）：100－104.

［17］Lo YM，Lun FM，Chan KC，et al.Digital PCR for the molecular detection of fetal chromosomal aneuploidy［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104（32）：13116－13121.