miR-21、miR-29c和miR-182鑒別診斷良惡性胸腔積液

袁榮霞，李堅(jiān)，金君，汪毅

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院1.呼吸內(nèi)科，2.中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江212001）

胸腔積液是多種疾病導(dǎo)致的胸膜腔液體滲出增多或回吸收障礙引起的臨床綜合征［1］，可分為良性和惡性。惡性胸腔積液主要由肺癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤的胸膜轉(zhuǎn)移或惡性胸膜間皮瘤所致［2－4］。腫瘤發(fā)生胸膜轉(zhuǎn)移形成惡性胸腔積液后，加重患者的臨床癥狀及惡病質(zhì)狀態(tài)，預(yù)后不佳，盡早診斷和治療可改善預(yù)后［5－6］。因此，良性和惡性胸腔積液的早期鑒別診斷極為重要。

惡性胸腔積液診斷的金標(biāo)準(zhǔn)包括胸腔積液脫落細(xì)胞檢查、胸膜活檢和胸腔鏡活檢病理檢查［7］。但胸腔積液脫落細(xì)胞檢查和胸膜活檢的陽(yáng)性率均較低，為40%～60%［8］。雖然胸腔鏡檢查陽(yáng)性率高，但創(chuàng)傷性大、費(fèi)用高，臨床難以廣泛開展應(yīng)用［9］。胸腔積液腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)用于惡性胸腔積液的診斷一直是人們的關(guān)注點(diǎn)［6，10－11］。與其他腫瘤標(biāo)志物相比，癌胚抗原診斷惡性胸腔積液具有較高的敏感度，但特異度不夠理想［7－8］。因此，探尋新的高敏感度和高特異度的腫瘤標(biāo)志物用于惡性胸腔積液的診斷很有必要。

由于microRNAs存在于血清、尿液、胸腔積液等體液中，易于獲取且具有較好的穩(wěn)定性，近年來被廣泛用于惡性腫瘤的診斷［12］。多項(xiàng)研究表明，miR-21、miR-29c和miR-182在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、直腸癌、胃癌和食管癌等患者的癌組織或血漿中的表達(dá)與對(duì)應(yīng)的癌旁組織及健康對(duì)照者血漿相比有顯著差異［13－18］，故有可能成為新的腫瘤生物標(biāo)志物。上述3種microRNAs在良惡性胸腔積液中的表達(dá)尚不清楚，因此，我們通過分析65例惡性胸腔積液標(biāo)本和61例良性胸腔積液標(biāo)本中miR-21、miR-29c和miR-182表達(dá)水平的差異，探討其在良惡性胸腔積液鑒別診斷中的意義。

1　病例與方法

1.1　研究對(duì)象

選取2015年4月至2017年6月在江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科、重癥監(jiān)護(hù)室和急診科住院治療的惡性胸腔積液患者65例，其中肺腺癌36例，肺鱗癌18例，小細(xì)胞肺癌5例，肺混合細(xì)胞癌1例，惡性胸膜間皮瘤1例，黏液纖維肉瘤、乳腺癌、前列腺癌及胰腺癌各1例。男42例，女23例，年齡38～93歲，平均69歲。所有患者均為初診初治患者，原發(fā)腫瘤均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診，胸腔積液的性質(zhì)均由脫落細(xì)胞檢查或胸膜活檢病理檢查明確。另選擇同期住院的良性胸腔積液患者61例，其中結(jié)核性胸膜炎39例，肺炎旁胸腔積液10例，心功能不全8例，膿胸2例，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及乳糜胸各1例。男45例，女16例，年齡19～98歲，平均62歲。所有患者亦為初診患者，原發(fā)疾病均符合該疾病最新診斷標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)選取20例健康者的血漿標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)microRNA對(duì)照（樣本microRNA校正值），其中男13例，女7例，年齡25～47歲，平均32歲。本研究符合人體試驗(yàn)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者在受試前簽署知情同意書。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1主要試劑及儀器 Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程有限公司；PCR引物購(gòu)自廣州銳博生物公司；MyCycler PCR儀為美國(guó)BioRad公司產(chǎn)品；Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國(guó)Stratagene公司產(chǎn)品。

1.2.2標(biāo)本處理 收集入組對(duì)象的胸腔積液標(biāo)本200 mL，分裝于含EDTA抗凝劑的試管中，留取10 mL送本院核醫(yī)學(xué)科檢測(cè)癌胚抗原；其余標(biāo)本于半小時(shí)內(nèi)以1 000×g離心5 min，棄上清液；加入等量紅細(xì)胞裂解液，500×g離心5 min，棄上清液；最后加4 mL PBS，1 000×g離心洗滌5 min，棄上清液；加入1 mL Trizol，于－80℃保存待用。

1.2.3RNA提取 取“1.2.2”處理后的標(biāo)本，解凍后加入200μL氯仿，震蕩，12 000 r／min離心15 min；吸取上層水相至EP管中，加入異丙醇沉淀水相中的總RNA；用75%乙醇洗滌2次，可見羽毛狀沉淀物；完全干燥后加入焦碳酸二乙酯處理過并經(jīng)高溫高壓消毒的DEPC水溶解。用分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度［D（260 nm）／D（280 nm）］在1.8～2.0之間，濃度在200～300 ng／mL之間。

1.2.4反轉(zhuǎn)錄 將1μg RNA和2μL反轉(zhuǎn)錄引物工作液混合，加入DEPC水配制成11μL體系，離心混勻；70℃加熱10 min，冰浴2 min。然后加入5×緩沖液5μL、反轉(zhuǎn)錄酶1μL以及無(wú)RNA酶的水8 μL，瞬時(shí)離心，避免產(chǎn)生氣泡。于反轉(zhuǎn)錄儀設(shè)置如下反應(yīng)程序：42℃60 min，70℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（RT-PCR）檢測(cè) miR-21、miR-29c和miR-182的表達(dá) 選取U6作為內(nèi)參基因。加入cDNA 2μL，熒光染料9μL，miRNA正向引物0.8μL，反向引物 0.8μL，熒光校正液Ⅱ0.4 μL，無(wú)RNA酶的水7μL配制20μL體系（此步操作在冰上進(jìn)行）?；靹?，按照95℃預(yù)變性20 s；95℃變性10 s，60℃延伸20 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)標(biāo)本的每個(gè)基因重復(fù)測(cè)定3次，并設(shè)置空白對(duì)照。收集每個(gè)標(biāo)本中U6、miR-21、miR-29c和miR-182的Ct值，用2－△△Ct方法計(jì)算各個(gè) microRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3　統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或近似t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。構(gòu)建受試者工作特征（ROC）曲線，獲取曲線下面積（AUC），確定臨界值，進(jìn)而計(jì)算敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值及準(zhǔn)確度。

2　結(jié)果

2.1　良惡性胸腔積液中miR-21、miR-29c和miR-182的表達(dá)

與良性胸腔積液相比，惡性胸腔積液中miR-21和 miR-182相對(duì)表達(dá)水平明顯增高（t＝4.231，t′＝3.738，P均 ＜0.05），miR-29c表達(dá)水平明顯降低（t′＝4.46，P＜0.05）。見圖1。

2.2　miR-21、miR-29c、miR-182和癌胚抗原診斷惡性胸腔積液的比較

ROC曲線顯示，miR-21、miR-29c和miR-182診斷惡性胸腔積液的 AUC值分別為0.873（SE＝0.033，95%CI：0.808～0.939）、0.856（SE＝0.034，95%CI：0.790～0.920）和 0.841（SE＝0.036，95%CI：0.772～0.911），均高于癌胚抗原診斷惡性胸腔積液的 AUC值（0.822，SE＝0.043，95%CI：0.703～0.873）。聯(lián)合檢測(cè) miR-21、miR-29c和 miR-182診斷惡性胸腔積液的 AUC值為0.949（SE＝0.021，95%CI：0.908～0.989）；聯(lián)合 miR-21、miR-29c、miR-182和癌胚抗原檢測(cè)診斷惡性胸腔積液的AUC值為0.986（SE＝0.007，95%CI：0.972～1.000），均高于單獨(dú)檢測(cè)的AUC值（圖2）。

根據(jù)ROC曲線分析結(jié)果分別取 0.193、0.036、0.008 96和 6.5作為 miR-21、miR-29c、miR-182和癌胚抗原診斷惡性胸腔積液的臨界值，計(jì)算其單獨(dú)及聯(lián)合診斷惡性胸腔積液的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確度，具體結(jié)果見表1。

圖1　m iR-21、m iR-29c和m iR-182在胸腔積液中的表達(dá)

圖2　m iR-21、m iR-29c、m iR-182和癌胚抗原的ROC曲線

3　討論

microRNAs可于翻譯水平抑制靶mRNAs，調(diào)節(jié)癌基因或抑癌基因的表達(dá)，從而參與腫瘤的發(fā)生、增殖和轉(zhuǎn)移。其中，體液microRNAs被外泌體包裹，在低溫、強(qiáng)酸和強(qiáng)堿等惡劣環(huán)境下可穩(wěn)定存在［19］。Erbes等［20］發(fā)現(xiàn)檢測(cè)尿液中 miR-155、miR-21、miR-125b、miR-2451的表達(dá)水平可作為乳腺癌篩查的非侵入性檢查方法。另發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)血漿中miR-20a、miR-145、miR-21、miR-223和 miR-221對(duì)于非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的早期診斷具有較高準(zhǔn)確性［21］。

表1　胸腔積液中m iR-21、m iR-29c、m iR-182和癌胚抗原的檢測(cè)對(duì)惡性胸腔積液的診斷效果　%

體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均顯示Ras癌基因通過兩個(gè)下游信號(hào)通路上調(diào)細(xì)胞miR-21的表達(dá)，表明miR-21在Ras誘導(dǎo)的癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮了重要作用［22］。Le等［23］報(bào)道肺癌患者血清miR-21水平明顯高于健康者，并且患者術(shù)后血清miR-21水平明顯低于術(shù)前，提示血清miR-21不僅可用于肺癌的診斷，還可作為監(jiān)測(cè)肺癌患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的標(biāo)志物。另有研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血漿中miR-21表達(dá)水平明顯高于健康者，且表達(dá)水平與腫瘤TNM分期顯著相關(guān)；其中接受含鉑類藥物化療獲得部分緩解的ⅢB和Ⅳ期患者血漿miR-21水平較獲得穩(wěn)定和進(jìn)展的患者血漿miR-21水平低數(shù)倍之多，提示血漿miR-21既可作為NSCLC診斷的標(biāo)志物，亦可用于預(yù)測(cè)NSCLC患者對(duì)含鉑類方案的化療療效［24］。沉默miR-182的表達(dá)可致轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中SMAD7的表達(dá)上調(diào)，從而抑制TGF誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤侵襲，表明miR-182是參與腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的 TGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要組成部分［25］。Wang等［26］報(bào)告胃癌患者血漿中miR-21和miR-182的表達(dá)水平明顯高于健康者，且二者高表達(dá)與患者的生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，體外實(shí)驗(yàn)證明miR-182高表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和遷移。上述研究結(jié)果表明，miR-21和miR-182參與腫瘤的發(fā)生、增殖及轉(zhuǎn)移，其在血液中的表達(dá)可作為腫瘤診斷的標(biāo)志物。本研究顯示，miR-21和miR-182在惡性胸腔積液中的表達(dá)明顯高于良性胸腔積液；此外，miR-21、miR-182診斷惡性胸腔積液的AUC值高于經(jīng)典的腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原，且敏感度及特異度均優(yōu)于癌胚抗原，與李威等［27］的研究結(jié)果基本吻合。由此表明，miR-21和miR-182可作為診斷惡性胸腔積液的生物標(biāo)志物。

Chen等［28］研究發(fā)現(xiàn)miR-29c是p53的下游靶基因，并證明PH樣結(jié)構(gòu)域家族成員2（PHLDB2）是miR-29c的關(guān)鍵靶基因，p53通過促進(jìn)miR-29c的表達(dá)下調(diào)PHLDB2，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，提示miR-29c在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起到抑癌基因的作用。Xu等［29］研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌患者血清miR-29c表達(dá)明顯低于健康對(duì)照者，表明測(cè)定血清miR-29c可作為食管鱗癌的無(wú)創(chuàng)篩選工具。然而Zhu等［30］報(bào)道，miR-29c在早期 NSCLC患者的腫瘤組織及血清中的表達(dá)分別高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織和健康者的血清，診斷敏感度及特異度高于血清癌胚抗原，提示血清miR-29c有可能作為診斷早期NSCLC的生物標(biāo)志物。本研究顯示miR-29c在惡性胸腔積液中的表達(dá)水平明顯低于良性胸腔積液，且其診斷惡性胸腔積液的敏感度、特異度及準(zhǔn)確度亦優(yōu)于癌胚抗原。本結(jié)果與Xu等研究結(jié)果相似，而與Zhu等結(jié)果相異，其原因尚不清楚，分析可能因素如下：研究對(duì)象種族的不同，腫瘤類型的差別，檢測(cè)標(biāo)本不同等。由于本研究中NSCLC所致惡性胸腔積液占了入組病例的大多數(shù)，胸腔積液miR-29c測(cè)定結(jié)果與Zhu等不同，具體有待進(jìn)一步研究。

此外，本研究證實(shí)聯(lián)合檢測(cè)胸腔積液miR-21、miR-29c和miR-182診斷惡性胸腔積液的敏感度和特異度優(yōu)于3項(xiàng)指標(biāo)的單獨(dú)檢測(cè)，三者與癌胚抗原聯(lián)合測(cè)定可進(jìn)一步提高診斷惡性胸腔積液的效能，表明聯(lián)合檢測(cè)胸腔積液中這些腫瘤標(biāo)志物對(duì)于鑒別診斷良惡性胸腔積液具有更顯著的價(jià)值。這與Zhu等［31］聯(lián)合檢測(cè)NSCLC患者血清miR-182和癌胚抗原可提高診斷效果的研究結(jié)果相似。

因此，胸腔積液miR-21、miR-29c和miR-182有可能成為新的腫瘤標(biāo)志物用于惡性胸腔積液的臨床診斷。

［參考文獻(xiàn)］

［1］Hsieh WY，Kuan TC，Cheng KS，et al.ACE／ACE2 ratio and MMP-9 activity as potential biomarkers in tuberculous pleural effusions［J］.Int J Biol Sci，2012，8（8）：1197－1205.

［2］Ried M，Hofmann HS.The treatmentof pleural carcinosis with malignant pleural effusion［J］.Dtsch Arztebl Int，2013，110（18）：313－318.

［3］Tang Y，Xu L.Superiority and clinical significance of Lunx mRNA in the diagnosis ofmalignant pleural effusion caused by pulmonary carcinoma［J］.J Exp Clin Cancer Res，2013，32（1）：37.

［4］Agrawal A，Tandon R，Singh L，et al.Clinico-pathological profile and course ofmalignant pleural effusion in a tertiary care teaching hospital in western U.P.with special reference to lung cancer［J］.Lung India，2015，32（4）：326－330.

［5］Sriram KB，Relan V，Clarke BE，et al.Pleural fluid cell-free DNA integrity index to identify cytologically negativemalignant pleural effusions includingmesotheliomas［J］.BMC Cancer，2012，12：428.

［6］Penz E，Watt KN，Hergott CA，et al.Management of malignantpleural effusion：challenges and solutions［J］.Cancer Manag Res，2017，9：229－241.

［7］Antonangelo L，Sales RK，CoráAP，etal.Pleural fluid tumourmarkers inmalignant pleural effusion with inconclusive cytologic results［J］.Curr Oncol，2015，22（5）：e336－341.

［8］Hooper C，Lee YC，Maskell N，etal.Investigation of a unilateral pleural effusion in adults：British Thoracic Society Pleural Disease Guideline 2010［J］.Thorax，2010，65（Suppl 2）：ii4－ii17.

［9］Shojaee S，Lee HJ.Thoracoscopy：medical versus surgical-in themanagement of pleural diseases［J］.J Thorac Dis，2015，7（Suppl 4）：S339－S351.

［10］Psatha A，Makris D，Kerenidi T，etal.A Potential role for VEGF in the diagnostic approach of pleural effusions［J］.JThorac Dis，2016，8（7）：1681－1687.

［11］Lee SH，Park MJ，Choi SI，et al.Reactive oxygen speciesmodulator 1（Romo1）as a novel diagnostic marker for lung cancer-related malignant effusion［J］.Medicine（Baltimore），2017，96（4）：e5975.

［12］Cortez MA，Bueso-Ramos C，F(xiàn)erdin J，et al.MicroRNAs in body fluids—themix of hormones and biomarkers［J］.Nat Rev Clin Oncol，2011，8（8）：467－477.

［13］Wang B，Zhang Q.The expression and clinical significance of circulatingmicroRNA-21 in serum of five solid tumors［J］.JCancer Res Clin Oncol，2012，138（10）：1659－1666.

［14］Guan P，Yin Z，Li X，et al.Meta-analysis of human lung cancermicroRNA expression profiling studies comparing cancer tissueswith normal tissues［J］.JExp Clin Cancer Res，2012，31（1）：54.

［15］Corcoran C，F(xiàn)riel AM，Duffy MJ，et al.Intracellular and extracellularmicroRNAs in breast cancer［J］.Clin Chem，2011，57（1）：18－32.

［16］Pass HI，Goparaju C，Ivanov S，etal.hsa-miR-29c*is linked to the prognosis ofmalignant pleuralmesothelioma［J］.Cancer Res，2010，70（5）：1916－1924.

［17］Han TS，Hur K，Xu G，et al.MicroRNA-29cmediates initiation of gastric carcinogenesis by directly targeting ITGB1［J］.Gut，2015，64（2）：203－214.

［18］Zhang QH，Sun HM，Zheng RZ，etal.Meta-analysis of microRNA-183 family expression in human cancer studies comparing cancer tissues with noncancerous tissues［J］.Gene，2013，527（1）：26－32.

［19］Qin X，Xu H，Gong W，et al.The tumor cytosolmiRNAs，fluid miRNAs，and exosome miRNAs in lung cancer［J］.Front Oncol，2015，4：357.

［20］Erbes T，Hirschfeld M，Rücker G，et al.Feasibility of urinary microRNA detection in breast cancer patients and its potential as an innovative non-invasive biomarker［J］.BMCCancer，2015，15：193.

［21］Geng Q，F(xiàn)an T，Zhang B，et al.Five microRNAs in plasma as novel biomarkers for screening of early-stage non-small cell lung cancer［J］.Respir Res，2014，15（1）：149.

［22］Frezzetti D，De Menna M，Zoppoli P，et al.Upregulation of miR-21 by Ras in vivo and its role in tumor growth［J］.Oncogene，2011，30（3）：275－286.

［23］Le HB，Zhu WY，Chen DD，et al.Evaluation of dynamic change of serum miR-21 and miR-24 in pre-and post-operative lung carcinoma patients［J］.Med Oncol，2012，29（5）：3190－3197.

［24］Wei J，GaoW，Zhu CJ，et al.Identification of plasma microRNA-21 as a biomarker for early detection and chemosensitivity of non-small cell lung cancer［J］.Chin JCancer，2011，30（6）：407－414.

［25］Yu J，Lei R，Zhuang X，et al.MicroRNA-182 targets SMAD7 to potentiate TGFβ-induced epithelial-mesenchymal transition andmetastasis of cancer cells［J］.Nat Commun，2016，7：13884.

［26］Wang X，Wang R，Li F，et al.Relationship between miR-21 and miR-182 levels in peripheral blood and gastric cancer tissue［J］.Oncol Lett，2017，14（2）：1427－1432.

［27］李威，陳燕明，陳曉軍，等.胸腔積液中 miRNA-21和miRNA-155表達(dá)的診斷價(jià)值［J］.江蘇醫(yī)藥，2012，38（16）：1882－1884.

［28］Chen G，Zhou T，Li Y，et al.p53 targetmiR-29c-3p suppresses colon cancer cell invasion and migration through inhibition of PHLDB2［J］.Biochem Biophys Res Commun，2017，487（1）：90－95.

［29］Xu H，Yao Y，Meng F，et al.Predictive value of serum miR-10b，miR-29c，andmiR-205 as promising biomarkers in esophageal squamous cell carcinoma screening［J］.Medicine（Baltimore），2015，94（44）：e1558.

［30］Zhu W，He J，Chen D，et al.Expression of miR-29c，miR-93，and miR-429 as potential biomarkers for detection ofearly stage non-small lung cancer［J］.PLoSOne，2014，9（2）：e87780.

［31］Zhu WY，Zhou K，Zha Y，etal.Diagnostic value of serum miR-182，miR-183，miR-210，and miR-126 levels in patients with early-stage non-small cell lung cancer［J］.PLoSOne，2016，11（4）：e0153046.