人參皂苷Rg1改善小鼠肢體缺血后血管新生

王曉麗，金躍，劉鷺，張凱，楊乃全

（徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第二人民醫(yī)院1.檢驗(yàn)科，2.心臟內(nèi)科，江蘇淮安223002）

下肢動(dòng)脈疾病（peripheral arterial disease，PAD）在2型糖尿病患者常見，常常是預(yù)后不好的標(biāo)志［1－2］。有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）功能受損在小鼠血管新生功能降低中發(fā)揮重要作用［3］。人參具有很高的醫(yī)用價(jià)值，目前已經(jīng)從人參中分離鑒定出大量的活性成分，其中人參皂苷Rg1是發(fā)揮人參功效的主要成分［4］。近來大量的數(shù)據(jù)提示Rg1能夠促進(jìn)血管新生以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、趨化、血管發(fā)生［5－8］。作為糖皮質(zhì)激素受體的配體，Rg1能夠增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶 B（Akt）及 eNOS的活化［9］。這些研究均提示Rg1具有潛在的促進(jìn)血管新生作用，也許可以作為一種新的治療下肢缺血的藥物。本研究通過制作小鼠后肢缺血模型，探討人參皂苷Rg1是否具有促進(jìn)小鼠缺血后肢血管新生的作用以及可能的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)分組

人參皂苷Rg1（純度＞96%）購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。雄性C57BL／6J小鼠20只隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組（n＝10）腹腔注射生理鹽水0.1 mL；Rg1治療組（n＝10）腹腔注射人參皂苷 Rg1（10 mg·kg－1）。每天給藥1次，連續(xù)2周。

1.2　后肢缺血模型的制作

所有小鼠以戊巴比妥（50 mg·kg－1）腹腔注射麻醉后，在操作顯微鏡的輔助下在右側(cè)后肢自腹股溝韌帶中點(diǎn)至膝上做一個(gè)縱形長(zhǎng)切口，顯露股動(dòng)脈，小心地將股動(dòng)脈與股靜脈和股神經(jīng)分離，將股動(dòng)脈自腹股溝韌帶處至膝上部分用7－0線結(jié)扎兩個(gè)結(jié)，切斷兩個(gè)結(jié)之間的股動(dòng)脈。左側(cè)后肢作為非缺血對(duì)照。

1.3　激光多普勒灌注成像儀檢測(cè)小鼠后肢血流灌注

結(jié)扎股動(dòng)脈后第14天，用激光多普勒灌注成像儀（PeriScan PIM 3，瑞典）測(cè)定小鼠后肢血流灌注恢復(fù)程度。以結(jié)扎側(cè)／未結(jié)扎側(cè)血流比值即LDPI指數(shù)比較不同組之間的差別［10］。

1.4　免疫熒光檢測(cè)缺血肢體毛細(xì)血管密度

在手術(shù)后2周，小鼠血流檢測(cè)后立即處死。收集每只小鼠缺血后肢的腓腸肌。腓腸肌包埋于OTC中，液氮速凍后制備成5μm冰凍組織切片。用免疫熒光染色法檢測(cè)毛細(xì)血管密度。每張玻片熒光顯微鏡（×200倍）隨機(jī)采集2～3個(gè)不同視野的圖像，用 Image-Pro Plus軟件（Media Cybernetics，Rockville，USA）分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的CD31及DAPI染色陽(yáng)性的區(qū)域。組織毛細(xì)血管密度以CD31陽(yáng)性區(qū)域面積除以DAPI染色陽(yáng)性區(qū)域面積的比值計(jì)算［10］。

1.5　比色法檢測(cè)缺血肢體一氧化氮分泌

手術(shù)后14 d，分離缺血肢體內(nèi)收肌和半膜肌，并用PBS沖洗去除多余的血液，0.1 g肌肉放在2 mL PBS（pH＝7.4）中勻漿，勻漿物 5 000×g離心 5 min，提取上清液即刻檢測(cè)一氧化氮濃度（碧云天生物技術(shù)有限公司）［11］。

1.6　TUNEL法檢測(cè)缺血肌肉細(xì)胞凋亡

術(shù)后第14天，收集缺血肢體腓腸肌，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成5μm切片。按照TUNEL試劑盒（In Situ Cell Death Detection kit，德國(guó) Roche公司）說明書進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.7　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件包處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　Rg1治療改善缺血肢體血流

手術(shù)后14 d，激光多普勒檢測(cè)結(jié)果顯示，Rg1治療明顯地改善了小鼠缺血肢體的LDPI指數(shù)（0.65±0.11），而對(duì)照組為 0.43±0.08，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝4.836，P＜0.05）。見圖1。

圖1　Rg1治療改善缺血肢體血流

2.2　Rg1治療增加缺血肢體毛細(xì)血管密度

免疫熒光定量檢測(cè)結(jié)果表明，Rg1治療組小鼠缺血肢體血管密度（CD31／DAPI比值）為0.65±0.11，與對(duì)照組（0.46±0.15）相比，Rg1治療使缺血肢體血管密度增加了0.4倍（t＝2.278，P＜0.05）。見圖2。

圖2　Rg1治療促進(jìn)了缺血肢體毛細(xì)血管的新生

2.3　Rg1治療降低缺血肢體細(xì)胞凋亡

TUNEL法染色凋亡細(xì)胞核為綠色，正常細(xì)胞核為藍(lán)色。結(jié)果顯示，Rg1治療組小鼠缺血組織細(xì)胞的凋亡［（20.3±6.3）%］較對(duì)照組顯著降低［（30.7±6.4）%，t＝3.682，P＜0.05］。見圖3。

圖3　Rg1治療降低缺血組織細(xì)胞的凋亡

2.4　Rg1治療增加缺血肢體組織一氧化氮的分泌

Rg1治療組缺血肢體組織一氧化氮的含量為（239.4±98.2）μmol／mL，對(duì)照組為（139.5±68.6）μmol／mL，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝2.637，P＜0.05）。

3　討論

本研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1治療能顯著地改善小鼠肢體缺血后血流再灌注以及血管再生，其潛在機(jī)制可能為增加一氧化氮的分泌，抑制缺血組織細(xì)胞的凋亡。

既往的研究發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓eNOS活化的下降會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員的受損［12］。有觀察提示NOS衍生的一氧化氮對(duì)適應(yīng)急性嚴(yán)重的肢體缺血，避免發(fā)生組織壞死和維持動(dòng)脈新生是必需的［13］。我們以前的研究表明人參皂苷Rg1提高了糖尿病小鼠及非糖尿病小鼠缺血肢體中磷酸化eNOS的表達(dá)［10］。所有這些研究表明，eNOS對(duì)促進(jìn)缺血組織血管新生具有重要作用。

研究已經(jīng)揭示，基本的細(xì)胞凋亡程序?qū)е铝瞬煌问降慕M織缺血后細(xì)胞丟失［14－15］，不受控制的細(xì)胞凋亡阻止了側(cè)支形成。我們的結(jié)果證實(shí)了人參皂苷Rg1治療能夠降低小鼠肢體缺血后細(xì)胞的凋亡。以前的研究發(fā)現(xiàn)Rg1治療能夠通過PI3K及Akt通路促進(jìn)功能性血管的新生，而PI3K及Akt通路已經(jīng)被證實(shí)在拮抗細(xì)胞凋亡中起作用［16－17］。PI3K及Akt通路是否參與了Rg1治療抑制肢體缺血后細(xì)胞凋亡還需要進(jìn)一步的研究。

本研究的主要局限是我們僅選擇了人參皂苷Rg1一種劑量，不同的治療劑量對(duì)小鼠下肢缺血后血管新生的確切作用還需要進(jìn)一步探討。

［參考文獻(xiàn)］

［1］Aboyans V，Lacroix P，Tran MH，et al.The prognosis of diabetic patientswith high ankle-brachial index depends on the coexistence of occlusive peripheral artery disease［J］.JVasc Surg，2011，53（4）：984－991.

［2］陳一文，秦明照.糖尿病下肢動(dòng)脈疾病與微血管病變的相關(guān)性［J］.中華老年心腦血管病雜志，2016，18（5）：551－552.

［3］Dong L，Kang L，Ding L，et al.Insulin modulates ischemia-induced endothelial progenitor cell mobilization and neovascularization in diabetic mice［J］.Microvasc Res，2011，82（3）：227－236.

［4］Radad K，Gille G，Moldzio R，et al.Ginsenosides rb1 and Rg1 effects on mesencephalic dopaminergic cells stressed with glutamate［J］.Brain Res，2004，1021（1）：41－53.

［5］Yue PY，Wong DY，Ha WY，et al.Elucidation of the mechanisms underlying the angiogenic effects of ginsenoside Rg（1）in vivo and in vitro［J］.Angiogenesis，2005，8（3）：205－216.

［6］Liang HC，Chen CT，Chang Y，et al.Loading of a novel angiogenic agent，ginsenoside Rg1 in an acellular biological tissue for tissue regeneration［J］.Tissue Eng，2005，11（5／6）：835－846.

［7］Sengupta S.Modulating angiogenesis：The yin and the yang in ginseng［J］.Circulation，2004，110（10）：1219－1225.

［8］Lin KM，Hsu CH，Rajasekaran S.Angiogenic evaluation of ginsenoside rg1 from panax ginseng in fluorescent transgenic mice［J］.Vascul Pharmacol，2008，49（1）：37－43.

［9］Leung KW，Cheng YK，Mak NK，etal.Signaling pathway of ginsenoside-rg1 leading to nitric oxide production in endothelial cells［J］.FEBSLetters，2006，580（13）：3211－3216.

［10］Yang NQ，Chen PS，Tao ZW，et al.Beneficial effects of ginsenoside-Rg1 on ischemia-induced angiogenesis in diabetic mice［J］.Acta Biochim Biophys Sin，2012，44（12）：999－1005.

［11］Wang M，Zhao XR，Wang P，et al.Glucose regulated proteins78 protects insulinoma cells（NIT-1）from death induced by streptozotocin，cytokines or cytotoxic T lymphocytes［J］.Int JBiochem Cell Biol，2007，39（11）：2076－2082.

［12］Gallagher KA，Liu ZJ，Xiao M，et al.Diabetic impairments in no-mediated endothelial progenitor cellmobilization and homing are reversed by hyperoxia and SDF-1α［J］.JClin Invest，2007，117（5）：1249－1259.

［13］Park B，Hoffman A，Yang Y，et al.Endothelial nitric oxide synthase affects both early and late collateralarterial adaptation and blood flow recovery after induction of hindlimb ischemia in mice［J］.J Vasc Surg，2010，51（1）：165－173.

［14］Shyu KG，Wang BW，Hung HF，et al.Mesenchymal stem cells are superior to angiogenic growth factor genes for improvingmyocardial performance in themousemodel of acute myocardial infarction［J］.J Biomed Sci，2006，13（1）：47－58.

［15］Lim H，F(xiàn)allavollita JA，Hard R，et al.Profound apoptosis-mediated regionalmyocyte loss and compensatory hypertrophy in pigs with hibernating myocardium［J］.Circulation，1999，100（23）：2380－2386.

［16］Cheung LW，Leung KW，Wong CK，etal.Ginsenosiderg1 induces angiogenesis via non-genomic crosstalk of glucocorticoid receptor and fibroblastgrowth factor receptor-1［J］.Cardiovasc Res，2011，89（2）：419－425.

［17］Li Y，Zhang D，Zhang Y，et al.Augmentation of neovascularization inmurine hindlimb ischemia by combined therapy with simvastatin and bone marrow-derived mesenchymal stem cells transplantation［J］.J Biomed Sci，2010，17：75.