鹽酸伊伐布雷定對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化的影響

李美玲，張衛(wèi)國(guó)，祝萬(wàn)潔

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450014

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是心血管疾病最主要的死因[1]。CHF最重要的病理學(xué)基礎(chǔ)是心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)[2]，因此抑制MF可控制CHF患者心功能的進(jìn)一步惡化。MF是指心臟基質(zhì)內(nèi)膠原纖維大量聚集、膠原含量增加或膠原成分發(fā)生變化[3]。心肌膠原纖維的表達(dá)調(diào)節(jié)涉及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等多種物質(zhì)，抑制CHF大鼠心肌組織中CTGF表達(dá)水平、增加心肌組織內(nèi)SOD含量，可能減緩CHF大鼠MF的進(jìn)程[4]。鹽酸伊伐布雷定(ivabradine hydrochlorid，Iva)是第一個(gè)應(yīng)用于臨床的高度特異性超極化的內(nèi)向離子流通道(If通道)的藥物，主要用途是控制竇性心率[5]。研究[6]顯示，Iva具有縮小心肌梗死面積、降低心肌耗氧量、延緩心力衰竭、改善心功能等作用，然而其對(duì)MF的影響尚不明確，為此，作者進(jìn)行了如下研究。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要藥品、試劑和儀器44只健康Wistar大鼠，體重200～250 g，購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。戊巴比妥鈉購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司，Iva購(gòu)自法國(guó)施維雅公司，RM-62000型四導(dǎo)電生理儀、SOD試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所，抗大鼠心肌組織CTGF多克隆抗體購(gòu)自美國(guó) Bio Vision公司，Western blot一抗、二抗稀釋液、封閉液、蛋白顯色試劑均購(gòu)自Sigma公司。751G-可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)(上海分析儀器廠)，高速勻漿機(jī)(上海弗魯克流體機(jī)械儀器制造有限公司)，酶標(biāo)記儀、電泳儀(美國(guó) Bio-Rad公司)

1.2實(shí)驗(yàn)分組及處理采用隨機(jī)數(shù)字表法將44只健康Wistar大鼠分為假手術(shù)組、模型組、Iva組、陽(yáng)性對(duì)照藥(倍他樂(lè)克)組。除假手術(shù)組外，其余3組大鼠均采用縮窄腹主動(dòng)脈的方法構(gòu)建CHF大鼠模型[7]：將戊巴比妥鈉配制成30 g/L，腹腔注射麻醉大鼠，在肋弓處沿前正中線切開(kāi)腹部皮膚，切口長(zhǎng)約2.5 cm，打開(kāi)腹腔，分離腹主動(dòng)脈，平行于腹主動(dòng)脈放置7號(hào)手術(shù)針并用0號(hào)絲線繞手術(shù)針結(jié)扎，取出手術(shù)針，確定腹主動(dòng)脈暢通，最后關(guān)腹。假手術(shù)組只分離腹主動(dòng)脈，但不結(jié)扎。大鼠手術(shù)后均連續(xù)3 d腹腔注射20萬(wàn)U青霉素G。術(shù)后第6周末測(cè)定大鼠心臟左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)，LVEDP≥15 mmHg為建模成功的標(biāo)準(zhǔn)。處理組動(dòng)物均建模成功，建模成功后Iva組每d灌胃10 mg/kg Iva，陽(yáng)性對(duì)照組每d灌胃10 mg/kg倍他樂(lè)克；假手術(shù)組和模型組每d灌胃10 mg/kg生理鹽水。第12周末，檢測(cè)大鼠LVEDP、心肌組織內(nèi)SOD含量及CTGF表達(dá)水平。

1.3檢測(cè)項(xiàng)目及方法①大鼠經(jīng)右頸總動(dòng)脈逆行插入導(dǎo)管至左心室，經(jīng)壓力換能器輸入RM-62000型四導(dǎo)電生理儀，記錄LVEDP。②大鼠處死后取部分心肌組織，用40 g/L多聚甲醛固定，剩余心肌組織高速勻漿，按ELISA試劑盒方法檢測(cè)心肌組織中SOD含量。③提取心肌組織中的總蛋白，用聚丙烯酰胺凝膠在220 V恒壓下電泳分離CTGF蛋白，然后把CTGF蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，用含脫脂奶粉的TBST液進(jìn)行封閉，放在搖床上水平慢搖1 h，加入CTGF一抗(按11 000稀釋)、β-actin一抗(按1400稀釋)，在4 ℃下孵育過(guò)夜，第2天再用TBST液漂洗3遍后，加入二抗(按120 000稀釋)在搖床上慢搖孵育1 h，最后DAB顯影。用Image J軟件分析蛋白顯影圖，用β-actin蛋白作對(duì)照，計(jì)算目的條帶的相對(duì)灰值度。④分別用HE、masson兩種染色方法觀察心肌組織纖維化程度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較各組大鼠LVEDP、心肌組織中CTGF表達(dá)水平和SOD含量，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1各組鼠LVEDP、心肌組織中CTGF表達(dá)水平和SOD含量的比較見(jiàn)表1。假手術(shù)組相比，模型組大鼠LVEDP增大，心肌組織中SOD含量減少，CTGF表達(dá)水平升高。與模型組比較，Iva組大鼠LVEDP減小，心肌組織中SOD含量增加，CTGF表達(dá)水平降低(P<0.01)。

表1　各組大鼠LVEDP、心肌組織中CTGF表達(dá)水平和SOD含量的比較

1 mmHg=0.133 kPa；*：組間兩兩比較，P均<0.01

2.2各組大鼠心肌組織病理學(xué)觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。HE染色顯示，假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清楚，排列整齊；模型組大鼠心肌細(xì)胞心態(tài)結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞斷裂、排列紊亂，炎性細(xì)胞增多，伴出血壞死；Iva組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)稍完整，排列稍齊，極少量炎細(xì)胞和少量出血壞死。Masson染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組未見(jiàn)膠原纖維沉積；模型組大鼠心肌細(xì)胞和血管周圍可見(jiàn)大量藍(lán)色的膠原纖維；Iva組有少量膠原纖維沉積。

A:假手術(shù)組;B:模型組;C:Iva組圖1　大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果(Masson染色，×200)

3　討論

本實(shí)驗(yàn)采用縮窄腹主動(dòng)脈導(dǎo)致容量負(fù)荷增加的方法制備CHF大鼠模型。臨床上常用LVEDP表示心臟的容量負(fù)荷。LVEDP增加導(dǎo)致充血性心力衰竭，長(zhǎng)期CHF可使心肌細(xì)胞發(fā)生纖維化。研究[8]顯示，當(dāng)CHF時(shí)，MF主要表現(xiàn)為膠原蛋白大量積聚，膠原蛋白含量增加。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)模型組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞斷裂，排列紊亂，大量藍(lán)色膠原纖維聚集，心肌細(xì)胞發(fā)生了纖維化。模型組大鼠心臟LVEDP比假手術(shù)組明顯增大，再次驗(yàn)證CHF會(huì)造成LVEDP升高。LVEDP升高會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目增加，ATP減少，膠原纖維合成增加，從而加速CHF大鼠MF的進(jìn)展。另外，LVEDP升高增加了心肌細(xì)胞耗氧量，心肌細(xì)胞缺氧，促進(jìn)CHF大鼠的MF。Iva組LVEDP減小，大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)稍完整、排列稍齊、膠原纖維沉積減少，提示Iva對(duì)CHF大鼠MF產(chǎn)生抑制作用可能與降低CHF大鼠LVEDP有關(guān)。

SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，可通過(guò)測(cè)定SOD含量間接評(píng)價(jià)MF。發(fā)生CHF時(shí)，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，心肌細(xì)胞合成的抗氧化酶減少，無(wú)法清除心肌細(xì)胞內(nèi)積聚的自由基，加劇CHF的MF。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織中SOD含量減少，這一研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了氧化應(yīng)激參與了CHF的MF的過(guò)程。有文獻(xiàn)[9-10]顯示，Iva可以減少慢性CHF大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的合成，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，Iva組大鼠心肌組織中SOD含量比模型組增加，表明Iva可能通過(guò)調(diào)節(jié)CHF大鼠心肌組織中SOD含量，從而對(duì)MF產(chǎn)生抑制作用。

CTGF因具有明顯的絲裂原性和趨化性，能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖，是發(fā)生MF的重要因子。免疫印跡結(jié)果顯示，模型組CTGF蛋白表達(dá)水平較假手術(shù)組升高，提示CHF大鼠MF與心肌組織中CTGF表達(dá)有關(guān)。與模型組相比，Iva組心肌CTGF蛋白表達(dá)水平降低，推測(cè)Iva對(duì)CHF大鼠MF產(chǎn)生抑制作用可能與心肌組織中CTGF的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

綜上所述，Iva可通過(guò)調(diào)節(jié)CHF大鼠LVEDP、心肌組織中SOD含量、心肌組織中CTGF表達(dá)水平，從而對(duì)CHF大鼠MF產(chǎn)生抑制作用。

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